狗牙根黑穗病病原菌的鑒定及其培養(yǎng)特性

羅海瀾+王飛+馬旭園+李新偉+劉少娟

摘要：狗牙根（Cynodon dactylon）是耕地、果園及其他草種草坪常見的惡性雜草，為探索其生物防治方法，試驗從患黑穗病狗牙根穗部分離到一株真菌LHL1，對其進行分子鑒定及生物學特性研究。液體發(fā)酵培養(yǎng)確定其最佳碳源和氮源及最適pH；苯胺藍染色、光學顯微鏡鏡檢法觀察感病狗牙根各部位菌絲和孢子分布情況。結(jié)果表明，菌株LHL1為擔子菌亞門（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌屬（Ustilago）；該菌的最佳碳源和氮源分別為甘油和水解乳蛋白，最佳pH為5；鏡檢結(jié)果顯示在感病植株的葉鞘內(nèi)表皮有大量菌絲及孢子分布，莖、葉及分蘗芽鞘表面均有孢子存在。

關(guān)鍵詞：狗牙根（Cynodon dactylon）； 菌株LHL1；生物防治

中圖分類號：S543+.9；S435.121.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0575-05

狗牙根（Cynodon dactylon）又名百慕達，為禾本科多年生草本植物，匍匐莖發(fā)達，蔓延力強[1，2]，根狀莖具有解熱利尿、舒筋活血的作用，葉提取物具降低血糖、抗氧化的作用[3]。狗牙根目前作為草坪草種廣受歡迎，但因其侵占性和再生性強，是耕地、果園及其他草坪草種的危害性雜草。

黑穗病是一種由幼苗期進行系統(tǒng)性侵染從而引發(fā)全株發(fā)病的病害，苗期侵染花期發(fā)病，花期穗上具充滿孢子堆的病癭[4]，感病花不能正常開花結(jié)子。狗牙根黑穗病的高發(fā)期在每年的7～9月，主要依靠孢子傳播。狗牙根黑穗病致病菌通過來自種皮或土壤的越冬孢子產(chǎn)生菌絲侵染發(fā)芽種子的胚芽鞘，并擴散至整個植物組織；狗牙根黑穗病致病菌對狗牙根的種子萌發(fā)、出苗無影響，但對匍匐枝的生長、干物質(zhì)總量的積累、競爭力都有明顯的降低作用[5]。在中國有關(guān)狗牙根黑穗病致病菌的研究鮮有報道；在其他國家，早在20世紀70年代對狗牙根黑穗病致病菌有相關(guān)報道，但主要集中在不同碳源及抗生素對菌落形態(tài)的影響，以及氯霉素對狗牙根黑穗病致病菌呼吸鏈電子傳遞的影響等[6，7]。

狗牙根黑穗病致病菌可嚴重影響狗牙根草坪生長成坪，但對防除田園狗牙根雜草具有積極作用。本研究從漯河醫(yī)學高等?？茖W校草坪患黑穗病狗牙根花穗上分離到一株真菌，對其進行了微生物學及分子生物學鑒定，以期為將狗牙根黑穗病致病菌開發(fā)成狗牙根生防菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 菌株LHL1由實驗室人員從漯河醫(yī)學高等專科學校草坪感病狗牙根穗分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和儀器 營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（每升成分：馬鈴薯20 g， 蔗糖20 g，瓊脂18 g），馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基（每升成分：馬鈴薯20 g， 蔗糖20 g），基礎(chǔ)培養(yǎng)基（用200 g馬鈴薯煮水后濾液定容至1 000 mL），1%酵母膏培養(yǎng)基；試劑均為分析純；Pfu高保真酶、底物以及總DNA提取試劑盒均采用北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品。OLYMPUS Bx51型光學顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]。LGJ-18S型冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化及保存

菌株分離：在超凈臺上將感病植株穗部輕輕接觸馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基，使孢子脫落至培養(yǎng)基，28 ℃光照培養(yǎng)至長出菌落，再挑單菌落接種于另一個馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基，進行菌株分離純化。獲得菌株LHL1于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基4 ℃保存。

1.2.2 培養(yǎng)方法

活化培養(yǎng)：將保存于4 ℃營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的菌株 LHL1接種于直徑9 cm的馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。

種子液培養(yǎng)：無菌條件下，用接種針從培養(yǎng)好的平皿中挑取單菌落接種于裝有100 mL 馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：無菌條件下，按0.6%接種量吸取種子液轉(zhuǎn)接于含100 mL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對LHL1菌落形態(tài)的影響 將菌株LHL1分別接種到8個1%酵母膏培養(yǎng)基上，并在其中7個培養(yǎng)基中分別添加3%蔗糖、4%葡萄糖、0.5%葡萄糖、3%果糖、3%麥芽糖、3%甘油、3%乳酸鈣，28 ℃培養(yǎng)5 d觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 處理設(shè)置 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為20 g/L的不同碳源：甘露糖、葡萄糖、果糖、甘油、麥芽糖、乳酸鈣、蔗糖，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d，以確定最佳碳源；20 g/L甘油+基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加濃度為2 g/L的不同氮源：氯化銨、硝酸鉀、尿素、甘氨酸、水解乳蛋白、酵母膏，以20 g/L甘油+基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK）；在馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH調(diào)pH至4、5、6、7、8、9、10。所有處理設(shè)3個重復。

1.2.5 LHL1菌株ITS鑒定 ITS鑒定采用試劑盒提取并純化LHL1菌株總DNA，對ITS保守序列進行PCR擴增獲得目的基因片段。通用引物分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR反應(yīng)體系如下：10×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，引物各1 μL，Taq酶l μL （5 U/μL），模板DNA 1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 °C退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 °C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗后送上海生工生物技術(shù)公司進行測序。

1.2.6 寄主體內(nèi)菌絲及孢子分布檢測 選取感病狗牙根的葉鞘內(nèi)表皮、葉表、莖表、莖髓、根表、分蘗幼芽鞘內(nèi)表皮進行菌絲及孢子鏡檢。用苯胺藍溶液（0.5 g苯胺藍，99 mL 蒸餾水，1 mL冰乙酸）染色10 min后光學顯微鏡下檢測[8]。其中葉片染色前用無水乙醇進行脫色處理。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 檢驗正態(tài)分布和1-way ANOVA 檢驗處理間均值差異，顯著性由統(tǒng)計軟件Statistical Analysis System Version 8完成，用Microsoft Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌株LHL1菌落形態(tài)的影響

根據(jù)“1.2.3”觀察不同培養(yǎng)基對菌株LHL1菌落形態(tài)的影響結(jié)果見圖1。由圖1可見，顯微鏡下3種菌落的菌形狀并無顯著差異，多數(shù)為分裂生長的梭狀菌體，少量菌絲。1%酵母膏培養(yǎng)基的菌落為覆膜狀，淺褐色、邊緣不規(guī)則（圖1B）；1%酵母膏+3%甘油培養(yǎng)基的菌落為褐色褶皺的白毛絨狀（圖1C）；1%酵母膏+4%葡萄糖培養(yǎng)基的菌落為雪花狀，白色、邊緣毛絨狀（圖1A），其他培養(yǎng)基的菌落形態(tài)與圖1A類同。

2.2 不同碳源對菌株LHL1生長量及菌形態(tài)的影響

不同碳源對菌株LHL1生長量的影響見圖2。由圖2可知，菌株LHL1在以甘油為碳源時生長量最大，其次為蔗糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖、果糖，以乳酸鈣為碳源時生長量最低。不同碳源對菌株LHL1形態(tài)的影響見圖3。由圖3可知，以乳酸鈣為碳源時菌株LHL1多為絲狀（圖3A），由老菌絲萌發(fā)形成新的菌絲；以蔗糖為碳源時菌株LHL1多為長橢圓形，呈現(xiàn)出芽殖或假絲狀（圖3B），其他碳源的菌形態(tài)與圖3B類同。這說明該菌在利用率較高的碳源上生長快，分裂旺盛；在利用率較低的碳源上生長慢，分裂少，多為絲狀延伸生長。

2.3 不同氮源對菌株LHL1生長量及菌形態(tài)的影響

以甘油為碳源，添加不同氮源后對菌株LHL1生長量的影響見圖4。由圖4可知，與對照相比，20 g/L甘油+基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氮源除尿素外均能促進菌株LHL1的生長，其中又以水解乳蛋白促生長效果顯著，其他依次為酵母膏、氯化銨、甘氨酸、硝酸鉀。值得注意的是培養(yǎng)基中添加尿素后檢測不到菌株LHL1的生長量，這可能與尿素導致培養(yǎng)基呈堿性有關(guān)。光學顯微鏡下觀察菌的形態(tài)，不同氮源對菌的形態(tài)沒有影響，菌體多為酵母狀裂殖生長；中間膨大呈橢圓形兩端細小，或一端膨大一端細小（圖5）。

2.4 不同初始pH對菌株LHL1生長量及菌形態(tài)的影響

不同初始pH的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基對菌株LHL1生長量的影響見圖6。由圖6可知，菌株LHL1在偏酸性環(huán)境中生長較好，當初始pH為4～7時生長量較高，初始pH為5時生長量最高；當初始pH偏堿性時，菌株LHL1生長量逐漸減少，初始pH為10時菌株LHL1生長量極低。這一結(jié)果與茭白狗牙根黑穗病致病菌生長適宜pH為5～6結(jié)果相符[9]。鏡檢發(fā)現(xiàn)（圖7）pH 4～6時菌株LHL1多為橢圓形，少數(shù)一端生長菌絲；pH 7～9時，菌株LHL1多數(shù)兩端生長菌絲。推測菌株LHL1適宜在弱酸性環(huán)境下生長，以分裂或出芽形式繁殖；在堿性條件下不利于其生長，分裂繁殖困難，菌體進行營養(yǎng)生長，兩端生長出菌絲。

2.5 ITS片段的序列測定和進化樹分析

本實驗室于2009年分離到菌株LHL1，經(jīng)柯霍氏法則確定該菌為狗牙根黑穗病致病菌，并對其進行分子生物學鑒定。用引物對菌株LHL1的 DNA做PCR擴增其ITS序列，擴增結(jié)果送上海生工測序。序列提交GenBank，獲登錄序列號JX477170。與NCBI上相似序列經(jīng)BLAST比對的結(jié)果表明：該菌株與Ustilago屬的Ustilago cynodontis UE的ITS序列相似度為95%，與 Ustilago tritici PDSUT2的ITS序列相似度為94%，與Basidiomycete sp. nasa47的ITS序列相似度為91%。根據(jù)比對結(jié)果，在GenBank中選取與ITS序列相似度高的菌株LHL1及狗牙根寄生菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，LHL1與Ustilago cynodontis UE構(gòu)成一枝。進化分析結(jié)合形態(tài)分析確定菌株LHL1屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌屬（Ustilago）。

利用序列比對軟件ClustalX 1.83和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PHYLIP3.68使用Neigh-bor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹， TreeView軟件示圖如圖8。

2.6 寄主體內(nèi)LHL1菌絲及孢子分布

用苯胺藍染色后對感病狗牙根的葉鞘內(nèi)表皮、葉片表皮、莖表皮、莖髓、根表皮、胚芽鞘表皮分蘗進行鏡檢，結(jié)果見表1。由表1可知，感病植株葉鞘內(nèi)表皮氣孔處有大量菌絲及孢子分布（圖9A），在葉鞘表面?zhèn)厶幘z和孢子集中分布（圖9B）。這可能是表皮的破損有利于菌絲由內(nèi)生長并產(chǎn)孢，也可能是外面的孢子更容易在破損處萌發(fā)存活；葉片表皮、葉鞘內(nèi)表皮、莖表皮及胚芽鞘表皮分蘗有少量孢子和菌絲分布；莖髓有菌絲檢出。這一結(jié)果表明該菌不僅在寄主穗部大量產(chǎn)孢，在寄主的葉鞘、葉、莖及胚芽鞘的表面都會產(chǎn)孢。在組織結(jié)構(gòu)比較幼嫩的葉鞘內(nèi)表皮和穗部大量產(chǎn)孢，其原因可能是組織結(jié)構(gòu)幼嫩有利于菌絲突破葉表皮結(jié)構(gòu)，穗部作為生殖器官營養(yǎng)物質(zhì)更為豐富，穗部表面積大，有利于菌絲生長、產(chǎn)孢。

3 小結(jié)與討論

本研究于2009年分離到菌株LHL1，經(jīng)柯霍氏法則確定該菌為狗牙根黑穗病致病菌。結(jié)果顯示，菌株LHL1在1%酵母膏中添加0.5%葡萄糖以及乳酸鈣為碳源時，LHL1菌落形態(tài)呈雪花狀，與前人報道的菌落形態(tài)為覆膜狀不同[6]。此外，發(fā)現(xiàn)這兩種培養(yǎng)基上的LHL1菌斑塊不能傳代生長，但將單菌落打散后用無菌水制成菌液再涂平板或劃線培養(yǎng)即能生長，是否存在菌自身生長限制因素，需要另做探究。菌株LHL1最佳碳源和氮源分別為甘油和水解乳蛋白，這與玉米瘤黑粉菌、水稻黑粉菌生長的最佳碳、氮源不同[10，11]。試驗中添加尿素菌株不能生長，pH為5時生長量最高，pH為10時菌體生長量最低，這也印證解釋了添加尿素為氮源時菌株LHL1不能生長的現(xiàn)象。當環(huán)境條件適宜其生長時，菌呈長橢圓形，以酵母方式分裂生殖，生長旺盛；環(huán)境不適宜時菌多呈菌絲態(tài)，分裂生殖少，生長量較低。Durieu等[6]也描述了狗牙根黑穗病致病菌存在菌絲和類酵母兩種形態(tài)，低糖、非發(fā)酵型糖、抗生素以及溴化乙錠可以誘導形成類酵母形態(tài)菌。本研究發(fā)現(xiàn)在不同碳源下，該菌落形態(tài)與Durieu等[6]報道的存在差異，可能由于不同時間和地理位置存在變種導致的。

早在上世紀70年代，國外有對狗牙根黑穗病致病菌的研究，由于當時的試驗條件受限都未進行分子鑒定[6，7]，本研究中經(jīng)ITS序列分析，確定狗牙根黑穗病致病菌屬黑粉菌屬。黑粉菌屬類菌在人工培養(yǎng)基上難完成生活史并產(chǎn)生冬孢子，該菌屬以冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生雙核菌絲入侵寄主幼苗生長錐，完成侵染過程。本研究中涉及到的多種固體和液體培基，菌株LHL1產(chǎn)生大量次生擔孢子，未見冬孢子形式。后期研究其菌絲及幾種孢子侵染寄主的能力，探究其開發(fā)生防菌潛力。

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