煙氣脫硝尾液厭氧氨氧化處理中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

李津，于德爽，趙丹，汪曉晨

青島大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071

煙氣脫硝尾液厭氧氨氧化處理中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

李津，于德爽，趙丹，汪曉晨

青島大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071

李津, 于德爽, 趙丹, 等. 煙氣脫硝尾液厭氧氨氧化處理中微生物群落結(jié)構(gòu)分析. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(12): 1865–1875.

Li J, Yu DS, Zhao D, et al. Microbial community in the Anammox process of thermal denitration tail liquid. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1865–1875.

采用厭氧序批式反應(yīng)器處理火電廠煙氣脫硝尾液并研究厭氧氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群為橢圓形的球菌且具有下凹的火山口狀，直徑約為0.7 μm。通過污泥總DNA提取、PCR擴(kuò)增、陽性克隆驗證和測序等分子生物學(xué)手段得到反應(yīng)器內(nèi)菌群16S rRNA基因序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹和克隆文庫。結(jié)果表明，在細(xì)菌通用引物27F-1 492R PCR擴(kuò)增的體系中，得到85個克隆子，分為21個OTU，各菌群所占的比例為：變形菌門Proteobacteria：61.18%；酸桿菌門Acidobacteria：17.65%；綠菌門Chlorobi：8.24%；綠彎菌門Chlorofexi：5.88%；芽單胞菌門Gemmatimonadetes：3.53%；硝化螺旋菌門Nitrospirae：2.35%；浮酶狀菌門Planctomycetes：1.18%。而在厭氧氨氧化菌特異引物pla46rc-630r; AMX368-AMX820 PCR擴(kuò)增的體系中有45個克隆子，分為3個OTU，其中Candidatus brocadia sp.占有95.6%，未知菌種4.4%。

煙氣脫硝尾液，厭氧氨氧化，16S rDNA克隆文庫，群落結(jié)構(gòu)，Candidatus brocadia sinica

厭氧氨氧化 (Anammox) 是一個自養(yǎng)過程，因不需要投加碳源可以節(jié)省運行成本[1-2]。厭氧氨氧化菌屬于浮霉?fàn)罹縋lanctomycetales的厭氧氨氧化菌科，該科有5個屬，10個種，皆為化能自養(yǎng)型厭氧菌并且具有厭氧氨氧化功能[3]。在這5個厭氧氨氧化菌屬中當(dāng)前有4個Anammox菌屬是從活性污泥中得到的，分別是“Kuenenia sp.”[4-5]，“Brocadia sp.”[6]，“Anammoxogiobus sp.”[7]和“Jettenia sp.”[8]。第5個厭氧氨氧化菌屬“Candidatus scalindua”[9-10]通?？梢栽谧匀簧持邪l(fā)現(xiàn)，尤其是在海底沉積物和海洋最低含氧帶。

Anammox菌形態(tài)多樣，呈球形、卵形等，直徑0.8?1.1 μm[11]。該菌是革蘭氏陰性菌；細(xì)胞外無莢膜；細(xì)胞壁表面有火山口形狀的結(jié)構(gòu)；少數(shù)有菌毛。細(xì)胞內(nèi)分隔成3部分：厭氧氨氧化體 (Anammoxsome)、核糖細(xì)胞質(zhì) (Riboplasm)及外室細(xì)胞質(zhì) (Paryphoplasm)[12]。

Anammox菌是一類難培養(yǎng)微生物，其生長速率較慢，倍增時間約為11 d，采用稀釋分離、平板劃線分離、顯微單細(xì)胞分離等傳統(tǒng)微生物分離方法均未分離成功[13]。這為ANAMMOX菌的酶學(xué)研究以及功能基因研究等帶來了不便。然而由于分子生物學(xué)技術(shù)可以直接從環(huán)境樣品中提取微生物的總DNA，不需要對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，從而成為研究厭氧氨氧化菌的最佳手段，如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 、熒光原位雜交 (FISH) 、DNA克隆測序、及梯度凝膠電泳 (DGGE) 等。其中16S rRNA基因序列分析技術(shù)是分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，已被廣泛用于研究微生物的分類、鑒定以及微生物群落分析，且在很多方面都取得了顯著成果[14]。

火電廠煙氣脫硝尾液具有較高的氨氮濃度(100?125 mg/L)、較低的B/C比 (低于0.1)，較高的進(jìn)水溫度 (30?40 ℃)，適合于采用Anammox工藝脫氮。試驗采用ASBR反應(yīng)器研究了火電廠煙氣脫硝尾液Anammox過程，經(jīng)過228 d培養(yǎng)及馴化實現(xiàn)了穩(wěn)定的厭氧氨氧化運行。取少量厭氧氨氧化活性污泥，通過DNA提取、PCR擴(kuò)增等一系列分子生物學(xué)手段獲得反應(yīng)器內(nèi)菌群的16S rRNA基因序列，通過構(gòu)建克隆文庫法對反應(yīng)器內(nèi)微生物種群進(jìn)行了多樣性分析，為火電廠煙氣脫硝尾液的厭氧氨氧化處理提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 污泥來源

實驗污泥取自水污染控制實驗室穩(wěn)定運行的ASBR厭氧氨氧化反應(yīng)器，反應(yīng)器裝置如圖1所示。反應(yīng)器采用有機(jī)玻璃制成，有效容積7 L，反應(yīng)器外壁采用黑布包裹，通過水浴加熱，使反應(yīng)器內(nèi)溫度控制在35 ℃。反應(yīng)器進(jìn)水氨氮和亞硝酸鹽氮分別為115 mg/L和140 mg/L左右，進(jìn)水pH值為7.5，水力停留時間為8 h，混合液污泥濃度保持在3 500 mg/L。在此條件下，反應(yīng)器對氨氮和亞硝酸鹽氮的去除率分別為91.5%和97.0%，脫氮性能良好。其中進(jìn)出水各項指標(biāo)如表1所示。

圖1 ASBR厭氧氨氧化反應(yīng)器流程圖Fig. 1 Flowchart of ASBR Anammox reactor.

表1 進(jìn)出水各項指標(biāo)Table 1 Indicators of influent and effluent

1.2 主要試劑及儀器

WisespinCF-1離心機(jī)；BIO-RAD PCR擴(kuò)增儀；DYY-7型電泳儀；水浴鍋；臺式紫外透射儀；移液槍；WH-3型漩渦振蕩儀；微型漩渦混合儀；低速離心機(jī)；迷你離心機(jī)。

MO BIO土壤DNA提取試劑盒，2×Taq PCR MasterMix，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)，PMD18-T載體，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。核酸染料，MSP，ALUⅠ限制性內(nèi)切酶。

引物由上海博尚生物科技有限公司合成，上游引物27F，Pla46rc, AMX368；下游引物1492R，630r，AMX820。引物的序列見表2。

1.3 方法

1.3.1 污泥總細(xì)菌DNA基因組的提取與PCR擴(kuò)增

污泥總DNA基因組的提取按照土壤基因DNA提取試劑盒說明書操作，完成后取5 μL收集好的DNA溶液用1%的瓊脂凝膠電泳檢測，其余分裝至微量離心管中?20℃保存。

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers

分別采用細(xì)菌通用引物 (27F-1492R) 和厭氧氨氧化特異引物 (pla46rc-630r; AMX368-AMX820) 對污泥樣品總DNA進(jìn)行16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增。其中通用引物擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序如下：細(xì)菌16S rRNA基因片段的PCR反應(yīng)體系 (50 μL)：1 μL引物27F (10 μmol/L)，1 μL引物1492R (10 μmol/L)，25 μL 2×Taq PCR MasterMix，2 μL細(xì)菌DNA模板，適量ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，52 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物以普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化。

采用浮霉?fàn)罹ㄓ靡锖图?xì)菌通用引物對pla46rc-630r及厭氧氨氧化菌特異引物對AMX368-AMX820對污泥樣品總DNA進(jìn)行巢式PCR，首先采用pla46rc-630r引物對進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，將第一輪得到的目的片段條帶純化后再作為模板以引物對AMX368-AMX820進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 (50 μL)：1 μL上游引物 (10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，25 μL 2×Taq PCR MasterMix，2 μL細(xì)菌DNA模板，適量ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件[15-16]：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，56 ℃ (第一輪PCR 擴(kuò)增) /52 ℃ (第二輪PCR擴(kuò)增) 退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.2 PCR產(chǎn)物的連接與克隆

微量離心管中依次加入：1 μL PMD18-T，2 μL PCR純化產(chǎn)物，2 μL ddH2O，5 μL SolutionⅠ(EDTA 5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5g/L)，低速離心后16 ℃反應(yīng)16 h。然后全量 (10 μL) 加入至50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30 min，42 ℃加熱60 s，再在冰中放置1 min，加入890 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。最后取50 μL上述連接產(chǎn)物涂布至含有X-gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)14 h后進(jìn)行藍(lán)白篩選，隨即挑選150個白色菌株 (細(xì)菌通用引物體系挑選100個，厭氧氨氧化特異引物體系挑選50個) 接種至5 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。

圖2 厭氧氨氧化菌顆粒污泥的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 2 SEM photo of Anammox bacteria granular sludge.

1.3.3 PCR法驗證陽性克隆及酶切

取200 μL上述菌液進(jìn)行沸水浴10 min，冰浴5 min制得PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：1 μL引物M-13-47 (10 μmol/L)，1 μL引物RV-M (10 μmol/L)，25 μL 2×Taq PCR MasterMix，2 μL細(xì)菌DNA模板，適量ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min ，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s ，32個循環(huán)，72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用MSP，ALUⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對挑選出的陽性克隆進(jìn)行酶切反應(yīng) (37 ℃，2 h)，將兩種酶切條帶都分別相同的克隆子認(rèn)定為同一個菌種。酶切結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

取樣時反應(yīng)器內(nèi)污泥總體呈現(xiàn)紅褐色，在取樣瓶壁上附著很多紅色顆粒污泥，挑選紅色顆粒進(jìn)行掃描電鏡結(jié)果如圖2所示，顆粒內(nèi)的菌群為橢圓形球菌聚集體。球形菌具有下凹的火山口狀，直徑約為0.7 μm，該結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)報道的厭氧氨氧化菌呈球形、卵形，直徑在0.8?1.1 μm的十分相似[17-19]。

2.2 污泥細(xì)菌總DNA提取

污泥樣品提取的總DNA經(jīng)凝膠電泳檢測，測得DNA濃度為：50.5 ng/μL。A260/A280=1.619，該比值用于評估所提取的DNA純度，一般認(rèn)為A260/A280在1.8±0.2范圍內(nèi)說明提取的DNA較為純凈，比值過低表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。本次總DNA該比值為1.619，說明所提取的DNA純度較高，不需要純化即可進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物27F-1492R，擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生一條1 500 bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。采用厭氧氨氧化菌特異引物 (pla46rc-630r) 以及 (AMX368-AMX820)，得到目的條帶在500 bp左右。張亞平等[20]采用相同引物得到目的片段大小為470 bp左右，與本實驗結(jié)果相似。本研究采用巢式PCR對厭氧氨氧化菌進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，第二輪擴(kuò)增時上游和下游引物均采用了Anammox菌的特異引物，該特異引物可以擴(kuò)增出不同種類的Anammox菌序列[1,20]，從而對反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌的多樣性分析更全面。

2.4 克隆文庫分析

經(jīng)過陽性克隆篩選，采用通用引物對27F-1492R的PCR體系共得到85個陽性克隆子，經(jīng)MSP，ALUⅠ酶切后共得到30個酶切類型，每個酶切類型挑選1?2個陽性克隆子送去測序，得到45個有效序列。去除兩端的載體序列，所得序列長度均在1 400?15 00 bp之間。將測序得到的序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對，尋找相似度最高及具有明確分類地位的已知16S rRNA基因序列，將所測序列與已知序列用Mega軟件進(jìn)行聚類分析，采用Neighbor-Joinin法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。將序列比對結(jié)果與同一個相關(guān)序列相似度相同的克隆子定義為一個操作單元 (OTU)，共得到21個OTU，建立克隆文庫表格如表3所示。

通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)，目前鑒定的厭氧氨氧化菌16S rRNA基因全序列中沒有與引物27F-1492R相匹配的序列，所以認(rèn)為引物27F-1492R對厭氧氨氧化菌并不具有通用性。文庫中主要菌群種類分布在變形菌門Proteobacteria，酸桿菌門Acidobacteria，綠菌門Chlorobi，綠彎菌門Chlorofexi，芽單胞菌門Gemmatimonadetes浮霉?fàn)罹TPlanctomycetes及硝化螺旋菌門Nitrospirae。

圖3 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of bacteria in the reactor.

表3 27F-1492R體系16S rDNA克隆文庫結(jié)果Table 3 16S rDNA clone library results of 27F-1492R system

其中變形菌門Proteobacteria所占的比例最高，共52個克隆子，豐度為61.18%，為樣品污泥除厭氧氨氧化菌之外的優(yōu)勢菌群。變形菌門中檢測到兩個亞綱的菌群，β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria，其中β-Proteobacteria內(nèi)菌種占變形菌門的84.62%，是變形菌門中的主要亞綱，γ-Proteobacteria有8個克隆子，占變形菌門的15.38%。在β-Proteobacteria中歸屬紅環(huán)菌科Rhodocyclaceae的克隆子有35個，伯克氏菌科Burkholderiaceae有9個克隆子。歸屬γ-Proteobacteria的主要菌屬有腸桿菌屬Enterobacter sp. 和不動桿菌屬Acinetobacter sp.以及Raoultella sp.。

酸桿菌門Acidobacteria是反應(yīng)器內(nèi)除了變形菌門的另一大菌群，共有15個克隆子占17.65%的比例。其余菌門按比例依次是綠菌門Chlorobi為8.24%，綠彎菌門Chlorofexi為5.88%，芽單胞菌門Gemmatimonadetes為3.53%，硝化螺旋菌門Nitrospirae為2.35%。浮霉?fàn)罹TPlanctomycetes為1.18%。

圖4 反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of anaerobic ammonia oxidizing bacteria in the reactor.

表4 pla46rc-630r，AMX368-AMX820體系16S rDNA克隆文庫結(jié)果Table 4 16S rDNA clone library results of pla46rc-630r, AMX368-AMX820 system

采用厭氧氨氧化菌特異引物(pla46rc-630r，AMX368-AMX820) 的體系中,共挑選出45個陽性克隆，經(jīng)酶切后共有7個酶切類型，每個酶切類型挑選1?2個陽性克隆子測序，共得到9個有效序列，根據(jù)這些序列在GenBank中檢索結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和克隆文庫如圖4和表4所示。厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)主要的厭氧氨氧化菌群分為3個OTU，其中分布在Candidatus Brocadia sp. 的占2個OTU，有43個克隆子，占總克隆子數(shù)的95.6%，與相關(guān)序列的相似度分別為100%和99%，說明這43個克隆子所代表的菌株基本屬于Candidatus Brocadia sp.，其中有26個克隆子與Candidatus Brocadia sinica JPN1同源相似度達(dá)100%，可以認(rèn)為反應(yīng)器內(nèi)存在的大部分厭氧氨氧化菌屬于Candidatus Brocadia sinica。而第3個OTU克隆子數(shù)為2個，占4.4%；與Uncultured Planctomycetales bacterium的相似度為95%，說明這兩個菌種可能是尚未被鑒定的菌種。

3 討論

采用厭氧氨氧化工藝處理煙氣脫硝尾液，反應(yīng)器內(nèi)除了厭氧氨氧化菌外還有其他菌群。其中，變形菌門中的β-Proteobacteria菌群占的比例最大。已有研究表明，β-Proteobacteria 是脫氮活性污泥系統(tǒng)中數(shù)量最豐富的優(yōu)勢菌群[21]，其大多數(shù)趨向于在厭氧環(huán)境下生存[22]。本研究發(fā)現(xiàn)的β-Proteobacteria的菌群主要分布在紅環(huán)菌目Rhodocyclates和伯克氏菌目Brukholderiales，這與方芳等[23]的研究結(jié)果類似。本研究的紅環(huán)菌目Rhodocyclates中存在有Thauera sp.，而該菌屬屬于反硝化細(xì)菌[24-25]，說明反硝化作用也在煙氣脫硝尾液的脫氮過程中發(fā)揮作用。

除了變形菌門，反應(yīng)器內(nèi)還存在著酸桿菌門、綠菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉?fàn)罹T和硝化螺旋菌門。研究表明，綠彎菌門是厭氧污泥消化器中的主要微生物[26]，并且厭氧氨氧化系統(tǒng)中存在綠彎菌門細(xì)菌對反應(yīng)器內(nèi)污泥的顆?；鸬揭欢ǖ淖饔肹5,27]。然而本研究中污泥始終呈松散狀態(tài)，沒有顆粒污泥的形成，這或許與本研究所采用的煙氣脫硝尾液特殊的廢水水質(zhì)有關(guān)。

采用厭氧氨氧化工藝處理煙氣脫硝尾液，厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)95.6%的厭氧氨氧化菌屬于Candidatus Brocadia sp.，其中57.8%與Candidatus Brocadia sinica的同源相似性達(dá)100%。有研究表明，在某一特定的生長環(huán)境中，厭氧氨氧化菌的生物多樣性較低，通常只有一個種屬的厭氧氨氧化細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢[7,28]，每種厭氧氨氧化菌都有特定的生存環(huán)境。Candidatus Brocadia sinica更適合處理煙氣脫硝尾液。

4 結(jié)論

采用ASBR反應(yīng)器處理火電廠煙氣脫硝尾液并研究了Anammox微生物群落結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群為橢圓形的球菌且具有下凹的火山口狀，直徑約為0.7 μm。通過構(gòu)建克隆文庫發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)95.6%的厭氧氨氧化菌屬于Candidatus Brocadia sp.，Candidatus Brocadia sinica更適合處理煙氣脫硝尾液。反應(yīng)器內(nèi)除了厭氧氨氧化菌外還有其他菌群，其中變形菌門中的β-Proteobacteria菌群占的比例最大，反硝化作用也在煙氣脫硝尾液的脫氮過程中發(fā)揮作用。

REFERENCES

[1] van de Graff AA, Mulder A, de Bruijn P, et al. Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process. Appl Environ Microb, 1995, 61(4): 1246?1251.

[2] Abma WR, Schultz CE, Mulder JW, et al. Full-scale granular sludge anammox process. Water Sci Technol, 2007, 55: 27?33.

[3] Starr MP, Schmidt JM. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York: Springer, 1995: 56?57.

[4] Schmid M, Twachtmann U, Klein M, et al. Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium oxidation. Syst Appl Microbiol, 2000, 23(1): 93?106．

[5] Strous M, Pelletier E, Mangenot S, et al. Deciphering the evolution and metabolism of an ANAMMOX bacterium from a community genome. Nature, 2006, 440(6): 790?794.

[6] Kuenen JG, Jetten MSM. Extraordinary anaerobic ammonium-oxidizing bacteria. Appl Environ Microb, 2001, 67: 456?463.

[7] Kartal B, Rattray J, van Niftrik LA, et al.Candidatus “Anammoxoglobus propionicus” a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria. Syst Appl Microbiol, 2007, 30(1): 39?49.

[8] Quan ZX, Rhee SK, Zuo JE, et al. Diversity of ammonium-oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) reactor. Environ Microb, 2008, 10(11): 3130?3139.

[9] Kuypers MMM, Slikers AO, Lavik G, et al. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea. Nature, 2003, 422: 608?611.

[10] Schmidt I, Sliekers O, Schmid M, et al. New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen removal in wastewater. FEMS Microbiol Rev, 2003, 27(4): 481?492.

[11] van Niftrik L, Geerts WJC, van Donselaar EG, et al. Linking ultrastructure and function in four genera of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria: cell plan, glycogen storage, and localization of cytochrome cproteins. J Bacteriol, 2008, 190(2): 708?717.

[12] van Niflrik LA, Fuerst JA, Damste JS, et al. The anammoxosome: an intracytoplasmic compartment in anammox bacteria. FEMS Microbiol Lett, 2004, 233(1): 7?13.

[13] Strous M, Heijnen JJ, Kuenen JG, et al. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammoniumoxidizing microorganism. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50: 589?596.

[14] Tan FX, Ye C. Molecular identification of 2 strains of Amromonas based on 16S rDNA sequence. J Yangtze Univ, 2011, 8(7): 257?262 (in Chinese).譚鳳霞, 葉聰. 基于16S rDNA序列的2株單胞菌屬細(xì)菌的分子鑒定. 長江大學(xué)學(xué)報, 2007, 8(7): 257?262.

[15] Shen LD, Hu BL, Zheng P, et al. Molecular detection of anammox bacteria in the sediment of West Lake, Hangzhou. Acta Sci Circum, 2011, 31(8): 1609?1615 (in Chinese).沈李東, 胡寶蘭, 鄭平, 等. 西湖底泥中厭氧氨氧化菌的分子生物學(xué)檢測. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2011, 31(8): 1609?1615.

[16] Fan GN, Zhu GB, Wang Y, et al. New functional microorganisms in nitrogen cycle restoration of river riparian ecosystems. Acta Sci Circum, 2010, 30 (8) : 1558–1563 (in Chinese).范改娜, 祝貴兵, 王雨, 等. 河流濕地氮循環(huán)修復(fù)過程中的新型功能微生物. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2010, 30(8): 1558?1563.

[17] Dalsgaard T, Canfield DE, Petersen J, et al. N2production by the anammox reaction in the anoxic water column of Golfo Dulce, Costa Rica. Nature, 2003, 422(6932): 606?608.

[18] Jetten M, Strous M, van de Pas-Schoonen KT, et al. The anaerobic oxidation of ammonium. FEMS Microbiol Rev, 1999, 22(6): 421?437.

[19] Egli K, Bosshard F, Werlen C, et al. Microbial composition and structure of a rotating biological contactor biofilm treating ammonium-rich wastewater without organic Carbon. Microb Ecol, 2003, 45(4): 419?432.

[20] Zhang YP, Luan XH. Molecular evidence for ammonia oxidation bacteria in the sediments of shallow lake: A case study in Yangcheng Lake．Acta Sci Circum，2012, 32(1): 182?189 (in Chinese).張亞平, 阮曉紅. 淺水湖泊(陽澄湖)沉積物氨氧化菌的分子證據(jù). 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2012, 32(1): 182?189.

[21] Lee HW, Lee SY, Lee JW, et al. Molecular characterization of microbial community in nitrate-removing activated sludge. FEMS MicrobEcol, 2002, 41(2): 85?94.

[22] Tao TS, Yang RF, Dong XZ, et al. Systematics of prokaryotes. Beijing: Chemistry Industry Press, 2007: 97?99 (in Chinese).陶天申, 楊瑞馥, 東秀珠, 等. 原核生物系統(tǒng)學(xué).北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 97?99.

[23] Fang F, Wang SM, Feng CJ, et al. Community structure of denitrifying bacteria in a hybrid AS-biofilm process under aerobic condition. Chin J Ecol, 2011, 30(3): 430?437 (in Chinese).方芳, 王淑梅, 馮翠杰, 等. 好氧條件下復(fù)合生物膜-活性污泥反應(yīng)器中的反硝化菌群結(jié)構(gòu). 生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 30(3): 430?437.

[24] Wang YH, Ma XY, Liu CF, et al. The bacterial diversity in boifilms associated with media of anammox bioreactors. J Dalian Ocean Univ, 2011, 26(6): 500?506.王銀華, 馬欣悅, 劉長發(fā), 等. 厭氧氨氧化反應(yīng)器載體生物膜細(xì)菌多樣性的研究. 大連海洋大學(xué)學(xué)報, 2011, 26(6): 500?506.

[25] Liu B, Zhang F, Feng X, et al. Thauera and Azoarcusas functionally important genera in a denitrifying quinoline-removal bioreactor as revealed by microbial community structure comparison. FEMS Microb Ecol, 2006, 55(2): 274?286．

[26] Rivière D, Desvignes V, Pelletier E, et al. Towards the definition of a core of microorganisms involved in anaerobic digestion of sludge. ISME J, 2009, 3(6): 700?714．

[27] Li XR, Du B, Fu HX, et al. The bacterial diversity in an anaerobic ammonium-oxidizing (ANAMMOX) reactor community. Syst Appl Microbiol, 2009, 32(4): 278?289.

[28] van de Vossenberg J, Rattray JE, Geerts W, et al. Enrichment and characterization of marine anammox bacteria associated with global nitrogen gas production. Environ Microb, 2008, 10(11): 3120?3129．

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Microbial community in the Anammox process of thermal denitration tail liquid

Jin Li, Deshuang Yu, Dan Zhao, and Xiaochen Wang
School of Environmental Science and Engineering, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong, China

An anaerobic sequencing batch reactor (ASBR) was used to treat thermal denitration tail liquid and microbial community was studied. Activated sludge was taken from the reactor for scanning electron microscope analysis. The images showed that the dominant cells in the flora were oval cocci. Its diameter was about 0.7 μm. Through a series of molecular biology methods such as extracting total DNA from the sludge, PCR amplification, positive clone authentication and sequencing, we obtained the 16S rDNA sequences of the flora. Phylogenetic tree and clone library were established. The universal bacteria primers of 27F-1492R PCR amplification system obtained 85 clones and could be divided into 21OTUS. The proportions were as follows: Proteobacteria 61.18%; Acidobacteria 17.65%; Chlorobi 8.24%; Chlorofexi 5.88%; Gemmatimonadetes 3.53%; Nitrospirae 2.35% and Planctomycetes 1.18%. The specific anammox bacterial primers of pla46rc-630r and AMX368-AMX820 PCR amplification system obtained 45 clones. They were divided into 3 OTUS. Candidatus brocadia sp. occupied 95.6% and unknown strains occupied 4.4%.

thermal denitration tail liquid, Anammox, 16S rDNA clone library, molecular community, Candidatus brocadia sinica

April 3, 2014; Accepted: August 13, 2014

Jin Li. Tel: +86-532-85955529; E-mail: ljin0532@126.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 51278258, 51478229), Qingdao Municipal Applied Fundamental Research Program (No. 13-1-4-203-jch).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 51278258, 51478229)，青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目 (No. 13-1-4-203-jch) 資助。

Received: April 3, 2014; Accepted: August 13, 2014

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 51278258, 51478229), Qingdao Municipal Applied Fundamental Research Program (No. 13-1-4-203-jch).

Corresponding author: Jin Li. Tel: +86-532-85955529; E-mail: ljin0532@126.com

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 51278258, 51478229)，青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目 (No. 13-1-4-203-jch) 資助。