篩選生物轉(zhuǎn)化H2/CO2氣體產(chǎn)乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌混培物

羅衎，符波，張麗娟，劉宏波，劉和

江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院 環(huán)境生物技術(shù)研究室，江蘇 無錫 214122

篩選生物轉(zhuǎn)化H2/CO2氣體產(chǎn)乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌混培物

羅衎，符波，張麗娟，劉宏波，劉和

江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院 環(huán)境生物技術(shù)研究室，江蘇 無錫 214122

羅羅, 符波, 張麗娟, 等. 篩篩篩篩篩篩H2/CO2氣氣氣氣酸的同同氣氣酸菌菌菌篩. 篩篩工程學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1889–1899.

Luo K, Fu B, Zhang LJ, et al. Screening of homoacetogen mixed culture converting H2/CO2to acetate. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1889–1899.

同型產(chǎn)乙酸菌是一類具有巨大工業(yè)應(yīng)用潛力的微生物類群，可利用合成氣生成乙醇和乙酸等燃料和化學(xué)品。本研究采集城市污泥樣品利用Hungate滾管法進(jìn)行同型產(chǎn)乙酸菌的篩選，并利用其進(jìn)行H2/CO2氣體的生物轉(zhuǎn)化，研究了pH對(duì)其乙酸和乙醇生成情況的影響。結(jié)果表明，所獲得的同型產(chǎn)乙酸菌混培物組成為永達(dá)爾梭菌，紡綞形賴氨酸芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌等。該混培物最適pH為5?7。pH為7時(shí)混培物利用H2/CO2氣體得到乙酸濃度可達(dá)到31.69 mmol/L。本研究獲得了一種可利用H2/CO2合成乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌混培物，為合成氣生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)應(yīng)用提供了有效的微生物資源。

同型產(chǎn)乙酸菌，篩選，生物轉(zhuǎn)化，pH，酵母提取物

Keywords: homoacetatogen, screen, biological conversion, pH, yeast extract

隨著化石能源的逐漸枯竭，利用微生物生產(chǎn)液體燃料和基本化學(xué)品，部分替代化石能源和石化產(chǎn)品是許多國家可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標(biāo)之一。合成氣 (主要由CO、H2、CO2組成的混合氣體) 是一種燃料和化學(xué)制品生產(chǎn)的主要原料，可由煤、可再生的生物質(zhì)和有機(jī)廢物等制得，并能通過化學(xué)催化法合成乙醇[1]。相比于化學(xué)轉(zhuǎn)化法，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)則更具吸引力[2]。因此，合成氣生物轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)具有巨大應(yīng)用前景的新興技術(shù)，對(duì)我國大力開發(fā)可再生能源具有非常重要的意義，且有利于國家的可持續(xù)發(fā)展。目前，國外在這一領(lǐng)域的研究處于試驗(yàn)階段，投入日益加大致力于其商業(yè)化規(guī)模應(yīng)用，而國內(nèi)研究剛剛起步[3]。

同型產(chǎn)乙酸菌 (Homoacetogen，HOMA) 是一類能夠通過乙酰輔酶A途徑將2分子的CO2還原為乙酸的厭氧微生物，無論在自養(yǎng)還是異養(yǎng)生長方式下，外源的CO2對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌的生長都是必不可少的[4]。同型產(chǎn)乙酸菌是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ墓I(yè)微生物，具有諸多工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，例如代謝底物廣，既能異養(yǎng)生長又能利用厭氧乙酰輔酶A途徑還原部分二氧化碳，厭氧生長但又耐受一定的氧氣，其代謝終產(chǎn)物有乙酸、乙醇、丁酸和丁醇等。混合培養(yǎng)生物技術(shù)已成為一個(gè)非常有前景的發(fā)展方向，其理念是從生物工程學(xué)的角度出發(fā)，結(jié)合環(huán)境生物技術(shù)的傳統(tǒng)元素，在處理廢棄物的同時(shí)又像工業(yè)生物技術(shù)那樣使產(chǎn)品最大化[5]，與基于純培養(yǎng)的工業(yè)生物技術(shù)相比較，混合培養(yǎng)技術(shù)擁有微生物多樣性帶來的適應(yīng)能力。

因此，在研究同型產(chǎn)乙酸菌的工業(yè)應(yīng)用技術(shù)時(shí)，分離獲得同型產(chǎn)乙酸菌的混合菌群以及了解其H2/CO2氣體生物轉(zhuǎn)化特性具有重要意義。本文對(duì)篩選獲得的混合菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，并研究了其H2/CO2氣體生物轉(zhuǎn)化效果。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基成分

富集培養(yǎng)基的成分如下[6](g/L)：甲酸鈉3.25，NH4Cl 0.5，KH2PO40.25，K2HPO40.25，MgCl2·6H2O 0.3；微量元素 (mg/L)：FeCl325，NiSO416，CaCl225，ZnCl211.5，CoCl·6H2O 10.5，CuCl2·2H2O 5，MnCl2·4H2O 15。50 mmol/L的2-溴乙烷磺酸鹽 (BrCH2CH2SO3，BES) 作為特異性產(chǎn)甲烷抑制劑[7]。

篩選培養(yǎng)基主要成分如下[8-10](g/L)：NH4Cl 0.5，K2HPO40.25，KH2PO40.25，MgSO40.3，NaHCO34.0，半胱氨酸-HCl·H2O 0.5，微量元素溶液10 mL/L，維生素溶液10 mL/L，pH 6.8?7.2；刃天青 (0.2%) 0.2 mL/L，固體培養(yǎng)基再添加1.5%?2.0%的瓊脂粉。微量元素溶液 (g/L)：CaCl20.025，NiSO40.03，ZnCl20.07，F(xiàn)eSO40.1，CoCl·6H2O 0.19，CuCl2·2H2O 0.01，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.02；維生素溶液 (mg/L)：生物素2.0，葉酸 2.0，維生素B610.0，維生素B15.0，維生素B25.0，煙酸 5.0，泛酸鈣 5.0，維生素B120.1，對(duì)氨基苯甲酸 5.0，硫辛酸 5.0 (生工生物工程(上海) 公司)。培養(yǎng)基的配制要保證過程的厭氧，配制培養(yǎng)基時(shí)通過對(duì)培養(yǎng)基加熱煮沸和N2(99.9%) 曝氣的方式 (15 min) 去除培養(yǎng)基中的溶解氧，并趁熱分裝到容器中，最后高壓蒸汽滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，將過濾除菌的維生素溶液加入到培養(yǎng)基中，混勻待用。

1.2 同型產(chǎn)乙酸菌的篩選和形態(tài)觀察

采集無錫太湖新城污水處理廠的二級(jí)沉淀池剩余污泥樣品，將樣品接種于厭氧瓶中富集培養(yǎng)基，充入99.9%純度的N2(15 min) 密封后置于110 r/min，37 ℃恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FTHFS基因來檢測(cè)同型產(chǎn)乙酸菌的富集情況[11]。

采用Hungate厭氧滾管法[12]對(duì)上述富集物中的同型產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行篩選。利用去氧無菌水將富集液進(jìn)行101?105梯度稀釋，厭氧管中分別加入5 mL 50 ℃的含有1 g/L酵母提取物的篩選培養(yǎng)基，取0.2 mL稀釋菌液依次加入到厭氧管中，快速輕輕混勻，然后在冰面上勻速滾動(dòng)，待厭氧管的管壁上有一層薄的固體培養(yǎng)基的時(shí)候?qū)捬豕芰⑵?，使多余的培養(yǎng)基流到管底[13]。用H2/CO2混合氣體 (H2：CO2=80%：20%，V/V)置換厭氧管中的氣體3次，密封后豎直放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。觀察到有菌落形成后，用自制的彎頭管將菌落分別挑出，放入裝有液體篩選培養(yǎng)基的厭氧瓶中擴(kuò)培，將厭氧瓶置于110 r/min、37 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)8 d。重復(fù)以上操作。以上實(shí)驗(yàn)操作均在Bactron anaerobic SL厭氧手套箱 (Sheldon，美國) 中進(jìn)行。利用相差光學(xué)顯微鏡 (Olympus，日本) 觀察混培物的微生物形態(tài)。

1.3 混合菌的功能基因檢測(cè)和組成分析

利用PowerSoil DNA提取試劑盒 (MOBIO，USA) 提取樣品DNA，以含同型乙酸菌菌液的DNA為陽性對(duì)照，以無菌水為陰性對(duì)照，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其功能基因FTHFS。PCR引物分別為fhsF和fhsR，詳細(xì)見表1。FTHFS基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考本實(shí)驗(yàn)之前建立的方法進(jìn)行[11]。

混培物的微生物組成利用克隆文庫技術(shù)進(jìn)行分析。提取的DNA利用引物27F與1401R (表1) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳后割膠回收PCR產(chǎn)物，連接至載體pGEM T-Easy后，轉(zhuǎn)化到E. coli JM109 (TaKaRa) 中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行Blast同源比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?？寺y(cè)序由生工生物工程 (上海) 公司完成。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增條件：25 μL反應(yīng)體系，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物(10 mmol/L) 各0.25 μL，DNA模板2 μL，TaKaRa Taq HS聚合酶 0.14 μL，加無菌水至25 μL；PCR反應(yīng)程序：4 ℃預(yù)冷5 min，95 ℃預(yù)變性10 min，隨后95 ℃變性1 min，60 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1 min共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃充分延伸10 min。

表1 細(xì)菌16S rRNA和同型乙酸菌FTHFS功能基因PCR引物Table 1 Primer sequences used for molecular characterization of mixed homoacetogen population

1.4 混培物生長曲線和生長pH值

菌濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取生長達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后的菌液50 mL于10 000 r/min離心20 min，棄上清液，菌體用無菌水清洗3次后再次離心，于105 ℃烘干至恒重；分別取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg菌體于干凈的離心管中，加入3 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基制成菌液，于600 nm處測(cè)定OD值；以O(shè)D值作為橫坐標(biāo)，細(xì)胞干重作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

生長曲線：250 mL厭氧瓶中加入100 mL含有1 g/L酵母提取物的篩選培養(yǎng)基 (2 g/L甲酸鈉為碳源) ，pH為7，頂空以99.9%的N2置換3次，接種5% (V/V) 的混培物菌液，將厭氧瓶置于110 r/min、37 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。每4 h取樣測(cè)OD值：以未接種的篩選培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每4 h取樣利用玻璃比色皿在紫外可見分光光度計(jì)UV-1600 (上海美譜達(dá)，中國) 于600 nm波長下測(cè)定OD值。

生長pH值：250 mL厭氧瓶中加入100 mL含有1 g/L酵母提取物的篩選培養(yǎng)基 (2 g/L甲酸鈉為碳源)，pH梯度設(shè)置為4、5、6、7、8、9、10和11，上部空間以99.9%的N2置換3次，接種5% (V/V) 的混培物菌液，將厭氧瓶置于110 r/min、37 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，間隔48 h取樣測(cè)定OD值。

1.5 H2/CO2氣體轉(zhuǎn)化特性研究

以接種量為5%接種菌液至含有1 g/L酵母提取物的篩選培養(yǎng)基中，pH分別設(shè)置為5、7、9、11，以H2/CO2為唯一碳源，實(shí)驗(yàn)組厭氧瓶的上部空間用H2/CO2混合氣體 (H2：CO2=80%：20%，V/V) 置換3次，對(duì)照組為N2，并加壓至150 kPa。

以接種量為5% (V/V) 接種菌液至篩選培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置酵母提取物濃度為0、0.05、0.1、0.5和1 g/L，pH設(shè)置為7，以H2/CO2為唯一碳源，實(shí)驗(yàn)組厭氧瓶的上部空間用H2/CO2混合氣體 (H2：CO2=80%：20%，V/V) 置換3次后同樣加壓至150 kPa，對(duì)照組為N2。以上每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)過程中利用氣相色譜GC-2010 (島津，日本) 檢測(cè)上部空間氣體中H2/CO2消耗情況以及液相中產(chǎn)物產(chǎn)生情況[15-16]。揮發(fā)性有機(jī)酸濃度 (VFA) 測(cè)量：用一次性滅菌注射器于厭氧瓶中取一定量的液體，將其經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾，取0.5 mL過濾后的樣品加入3 mol/L H3PO40.5 mL進(jìn)行酸化處理，然后加入0.5 mL四甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo)，充分混勻后以10 000 r/min離心10 min，最后取1 mL離心后的樣品加入到GC小瓶中，置于GC-2010測(cè)VFA成分和濃度。GC2010配置和測(cè)定程序設(shè)置為：采用火焰離子型檢測(cè)器 (FID) 和毛細(xì)管柱 (PEG-20M，30 m × 0.32 mm × 0.5 μm，China)，99.99%的高純N2作為載氣，柱箱初始溫度為80 ℃，保留3 min，之后以每分鐘15 ℃升高至210 ℃，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250 ℃。H2/CO2氣體濃度測(cè)量：每天測(cè)量時(shí)先測(cè)定H2/CH4/CO2(34.62%：30.26%：35.12%，V/V/V) 標(biāo)準(zhǔn)氣體，每個(gè)樣品測(cè)定之前需要用待測(cè)氣體樣品“潤洗”進(jìn)樣針3次，之后用進(jìn)樣針取50 μL氣體樣品注入進(jìn)樣口進(jìn)行測(cè)量樣品成分和含量。GC-2010配置和測(cè)定程序設(shè)置為：采用熱導(dǎo)檢測(cè)器 (TCD) 和不銹鋼填充柱 (porapak Q，2 m × 4 mm，China)，99.99%的高純N2作為載氣，柱箱溫度為80 ℃，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度為150 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 混培物的篩選

通過Hungate厭氧滾管法獲得了一種混培物，命名為Ca1。厭氧管中的菌落呈白色、圓形，直徑大約1 mm (圖1A)。再經(jīng)過革蘭氏染色觀察到幾種不同形狀的細(xì)菌，其中大部分是呈現(xiàn)革蘭氏陽性的梭狀 (長1.5?1.9 μm，寬0.8?0.9 μm) 和桿狀菌 (長1.5?2.0 μm)，還有少量的革蘭氏陰性球菌 (圖1B)。

同型產(chǎn)乙酸菌不是系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上一個(gè)確定的類群，而是一類具有相同代謝能力，即能利用H2/CO2合成乙酸的微生物類群。甲基四氫葉酸合成酶是同型乙酸菌乙酰輔酶A途徑的關(guān)鍵酶，乙酰輔酶A途徑中甲基四氫葉酸合成酶基因 (FTHFS) 是同型產(chǎn)乙酸菌一段高度保守的基因，有學(xué)者據(jù)此設(shè)計(jì)引物研究了同型產(chǎn)乙酸菌種群在不同自然生境中的多樣性和分布狀況[17]。許科偉等[11]設(shè)計(jì)出特異性和靈敏度更高的引物，并對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后，證明了FTHFS引物對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌的特異性識(shí)別。目前環(huán)境樣品中同型產(chǎn)乙酸菌的檢測(cè)和定量多通過測(cè)定FTHFS基因進(jìn)行，因此，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增FTHFS基因的陽性和陰性可反映同型產(chǎn)乙酸菌存在與否。本實(shí)驗(yàn)混培物DNA樣品的FTHFS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈陽性，這表明了混培物中同型產(chǎn)乙酸菌的存在。

2.2 混培物的微生物組成

克隆測(cè)序結(jié)果登陸NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)混培物中序列相似性大于97%的細(xì)菌至少有3種，分別命名為Ca1-1、Ca1-2和Ca1-3，相對(duì)應(yīng)的細(xì)菌分別為永達(dá)爾梭菌Clostridium ljungdahlii (97%)、紡綞形賴氨酸芽胞桿菌Lysinibacillus fusiformis (98%) 和蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus (99%)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，將Ca1-1序列上傳至GenBank，獲得登陸號(hào)KJ094502。

圖1 同型產(chǎn)乙酸菌混培物Ca1菌落圖 (A) 和顯微鏡照片 (B)Fig. 1 The photograph of colony (A) and microscope image of mixed culture Ca1 (B).

根據(jù)Drake等的研究結(jié)果，環(huán)境中的絕大部分同型產(chǎn)乙酸菌都分布在Firmicutes和Spirochaetes菌門，共包含21個(gè)屬，而Clostridium和Acetobacterium是最常見的同型產(chǎn)乙酸菌屬，其中Clostridium ljungdahlii是Clostridium中一種典型的同型產(chǎn)乙酸菌[18-19]。C. ljungdahlii是梭菌中第一個(gè)被認(rèn)定為rRNA同源性I組的產(chǎn)乙酸菌，其他還包括Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii等；C. ljungdahli是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽胞的厭氧桿菌，能夠利用H2/CO2、CO自養(yǎng)生長，同樣能夠利用葡萄糖、果糖、木糖、甲酸鹽、丙酮酸鹽、乙醇等異養(yǎng)生長，主要產(chǎn)物為乙酸，也產(chǎn)生少量乙醇，最適溫度和最適初始pH分別為37 ℃和6[10]。

2.3 混培物生長曲線和生長pH值

圖3A是混培物隨時(shí)間變化的生長濃度，可見經(jīng)過4 h的遲緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，32 h后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)菌生長濃度能達(dá)到550 mg/L (以細(xì)胞干重計(jì)) 以上。根據(jù)Cotter等[20]的報(bào)道，C. ljungdahlii的合成氣純培養(yǎng)中，8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，40 h后達(dá)到穩(wěn)定期，可能由于是利用氣體H2/CO2作為底物，因此遲緩期較長。而本研究是以可溶性的甲酸鈉作為底物，微生物利用性更高。

圖2 基于16S rRNA 序列和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences and Neighbor-Joining analysis.

混培物Ca1能夠在pH 5?10的范圍內(nèi)生長，pH 5?7時(shí)混培物菌濃度較高，達(dá)到529 mg/L以上 (圖3B)。C. ljungdahlii的pH生長范圍一般在5?7[3]。混培物生長的pH區(qū)間更大，且細(xì)菌濃度較高，這可能是混培物中幾種細(xì)菌相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，使得混培物能更好地適應(yīng)pH的變化。

2.4 初始pH對(duì)H2/CO2氣體轉(zhuǎn)化的影響

H2和CO2上部空間氣體消耗情況見圖4所示，初始pH 9、11條件下，上部空間氣體 CO2會(huì)有一部分被培養(yǎng)基中NaOH所吸收，因此在培養(yǎng)的第一天會(huì)急劇下降。因酵母提取物中有機(jī)碳被利用產(chǎn)生CO2，使得此后的1?2 d上部空間氣體中CO2小幅回升，與此同時(shí)同型產(chǎn)乙酸菌利用H2/CO2氣體使得CO2和H2濃度降低。結(jié)果如圖5所示，初始pH 7和pH 9時(shí)乙酸濃度均較高，并無顯著性差異 (P＞0.05)，乙酸濃度大約為32 mmol/L。初始pH 9時(shí)有機(jī)酸生成使得反應(yīng)體系的pH隨著反應(yīng)的進(jìn)行而降低，逐漸穩(wěn)定在pH為6.1?6.9，可見，中性初始pH值適宜該混培物利用H2/CO2氣體產(chǎn)乙酸。Cotter等[20]的研究也顯示中性條件 (pH 6.8) 比酸性條件 (pH 5.5) 更有利于菌的生長和乙酸的產(chǎn)生。

圖3 混培物的生長曲線 (A) 和不同pH時(shí)細(xì)菌生長濃度 (B)Fig. 3 The growth trends of mixed culture (A) and the culture density under different pH (B).

根據(jù)公式 (1) 計(jì)算理論情況下同型產(chǎn)乙酸菌利用H2/CO2產(chǎn)乙酸的濃度。pH 7時(shí)氣體消耗量經(jīng)過物料衡算可以得出與氣體消耗值相對(duì)應(yīng)的乙酸產(chǎn)量為11.86 mmol/L，而空白實(shí)驗(yàn)組得到的乙酸產(chǎn)量經(jīng)計(jì)算大約為8.60 mmol/L (圖5)。實(shí)際測(cè)定得到的乙酸濃度為31.69 mmol/L (圖5)，可見乙酸濃度要高于由H2/CO2氣體轉(zhuǎn)化與對(duì)照空白兩者乙酸濃度的加和，這可能微生物利用酵母提取物的同時(shí)會(huì)釋放一定量的CO2，這可由圖4中CO2氣體在第一天降低后回升顯示，有機(jī)物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的CO2被同型產(chǎn)乙酸菌利用合成乙酸。

圖4 不同初始pH時(shí)CO2和H2氣體含量變化Fig. 4 Variations of carbon dioxide and hydrogen concentration at different initial pH.

圖5 不同初始pH時(shí)混合菌轉(zhuǎn)化H2/CO2生成乙酸和乙醇濃度變化Fig. 5 Changes in acetate and ethanol concentrations during bioconversion of H2/CO2at different initial pH.

本實(shí)驗(yàn)中乙酸濃度與Cotter等的報(bào)道相比基本一致[20]，乙醇產(chǎn)量則較低，但是理論計(jì)算由H2/CO2氣體貢獻(xiàn)得到的乙酸量比Cotter報(bào)道的要低。這可能是Cotter等學(xué)者對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行持續(xù)曝氣合成氣，這極大地增加了氣液傳質(zhì)效率，合成氣轉(zhuǎn)化效率更高，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量就更高。Younesi等[21]利用C. ljungdahlii純菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化合成氣CO、CO2和H2時(shí)，乙酸濃度為大約1.0 g/L (即16.7 mmol/L)。相比之下，混培物轉(zhuǎn)化H2/CO2氣體乙酸濃度更高。

2.5 酵母提取物濃度對(duì)H2/CO2氣體轉(zhuǎn)化的影響

如圖6所示，無酵母提取物和酵母提取物濃度為0.05 g/L的實(shí)驗(yàn)組中H2幾乎沒有消耗，CO2的降低可能是由于堿性溶液的吸收。酵母提取物濃度為0.5 g/L和1 g/L的上部空間H2消耗比較明顯，分別減低了大約0.6 mmol和0.9 mmol。

圖6 不同酵母提取物濃度時(shí)CO2和H2氣體濃度變化Fig. 6 Variations of carbon dioxide and hydrogen concentration at different yeast extract concentrations.

如圖7所示，無酵母提取物添加時(shí)，H2消耗較少，相應(yīng)的乙酸生成量很少，而添加酵母提取物時(shí)乙酸濃度相應(yīng)升高，這表明酵母提取物可能對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌的生長是必不可少的[22]。酵母提取物濃度為0.05 g/L時(shí)，乙酸濃度較低為1.5 mmol/L，相應(yīng)于氫氣消耗量較少，乙酸的生成可能主要來源于酵母提取物中有機(jī)碳的降解。酵母提取物濃度大于0.5 g/L時(shí)乙酸濃度明顯提高，這與CO2氣體作為唯一碳源時(shí)酵母提取物的濃度≥0.5 g/L乙酸濃度升高的報(bào)道相一致[23]。而在Cotter等[20]的研究中把酵母提取物濃度提高到3 g/L，并在連續(xù)注入合成氣的實(shí)驗(yàn)中，乙酸的最終濃度能達(dá)到35 mmol/L以上，高于本實(shí)驗(yàn)僅由H2/CO2貢獻(xiàn)得到的乙酸濃度(24.19 mmol/L)，說明提高酵母提取物濃度對(duì)產(chǎn)乙酸是有利的。

添加酵母提取物有利于促進(jìn)同型產(chǎn)乙酸菌的生長，而乙酸是同型產(chǎn)乙酸菌生長偶聯(lián)型產(chǎn)物，因此對(duì)乙酸濃度的提高有一定的促進(jìn)作用。但目前對(duì)于酵母提取物的研究大都集中在產(chǎn)乙醇，Guo等[24]的研究表明，酵母提取物對(duì)于同型產(chǎn)乙酸菌產(chǎn)乙醇有顯著影響，低濃度時(shí)有利于產(chǎn)生更多的乙醇。而酵母提取物濃度過低不利于細(xì)菌的生長，因此有人提出添加酵母提取物促進(jìn)同型產(chǎn)乙酸菌生長，然后降低酵母提取物濃度或是去掉酵母提取物造成營養(yǎng)缺陷使得同型產(chǎn)乙酸菌積累其非生長偶聯(lián)產(chǎn)物—乙醇[2]。

圖7 酵母提取物濃度不同時(shí)轉(zhuǎn)化H2/CO2產(chǎn)生乙酸濃度變化Fig. 7 Changes in acetate concentrations during bioconversion of H2/CO2at different yeast extract concentrations.

3 結(jié)論

本研究以CO2/H2作為底物從城市污泥中篩選得到一個(gè)同型乙酸菌混培物，其組成包含Lysinibacillus fusiformis、Bacillus cereus和Clostridium ljungdahlii。該混培物初始pH生長范圍為5?10，最適初始pH為5?7。適宜pH 值條件下混培物轉(zhuǎn)化CO2/H2生成乙酸的濃度達(dá)到30 mmol/L以上。酵母提取物對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌生長必不可少，當(dāng)酵母提取物在培養(yǎng)基中濃度≥0.5 g/L時(shí)，混培物轉(zhuǎn)化CO2/H2氣體生成乙酸的濃度隨著酵母提取物濃度增加而提高，酵母提取物濃度為1 g/L時(shí)，乙酸濃度為26 mmol/L以上。

REFERENCES

[1] Subramani V, Gangwal SK. A review of recent literature to search for an efficient catalytic process for the conversion of syngas to ethanol. Energy Fuels, 2008, 22(2): 814?839.

[2] Mohammadi M, Najafpourb GD, Younesic H, et al. Bioconversion of synthesis gas to second generation biofuels: a review. Renew Sustain Energy Rev, 2011, 15: 4255?4273.

[3] Xu HJ, Xu JL, Guo Y, et al. Anaerobic fermentation of synthesis gas for organic acids and alcohols production. Chin Biotechnol, 2010, 30(3): 112?118 (in Chinese).徐慧娟, 許敬亮, 郭穎, 等. 合成氣厭氧發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸和醇的研究進(jìn)展. 中國生物工程雜志, 2010, 30(3): 112?118.

[4] Guo W, Liu C, Zou SL, et al. Progress in research and application of homoacetogen. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12: 874?877 (in Chinese).郭蔚, 劉成, 鄒少蘭, 等. 同型乙酸菌研究進(jìn)展及應(yīng)用前景. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12: 874?877.

[5] Kleerebezem R, van Loosdrecht MCM. Mixed culture biotechnology for bioenergy production. Curr Opin Biotechnol, 2007, 18: 207–212.

[6] Oh SE, Van Ginkel S, Logan BE. The relative effectiveness of pH control and heat treatment for enhancing biohydrogen gas production. Environ Sci Technol, 2003, 37: 5186?5190.

[7] Xu KW, Liu H, Chen J. Effect of classic methanogenic inhibitors on the quantity and diversity of archaeal community and the reductive homoacetogenic activity during the process of anaerobic sludge digestion. Bioresour Technol, 2010, 101: 2600?2607.

[8] Stams AJM, van Dijk JB, Dijkema C, et al. Growth of syntrophic propionate-oxidizing bacteria with fumarate in the absence of methanogenic bacteria. Appl Environ Microbiol, 1993, 59: 1114–1119.

[9] Grech-Mora, Fardeau ML, Patel BKC, et al. Isolation and characterization of Sporobacter termitidis gen. nov., sp. nov., from the digestive tract of the wood-feeding termite Nasutitemes lujae. Int J Syst Bacteriol, 1996, 46(2): 512?518.

[10] Tanner RS, Miller LM, Yang D. Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. Int J Syst Bacteriol, 1993, 43(2): 232–236.

[11] Xu KW, Liu H, Du GC, et al. Real-time PCR assays targeting formyltetrahydrofolate synthetase gene to enumerate acetogens in natural and engineered environments. Anaerobe, 2009, 15: 204?213.

[12] Hungate RE. Methods in Microbiology. New York: Academic Press, 1969: 117?132.

[13] Li YF, Ren NQ, Chen Y, et al. The experimental anaerobic operation of isolation and culture on hydrogen-producting and fermentative bacteria. J Harbin Inst Technol, 2004, 36(12): 1589?1592 (in Chinese).李永峰, 任南琪, 陳瑛, 等. 發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌分離培養(yǎng)的厭氧實(shí)驗(yàn)操作技術(shù). 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 36(12): 1589?1592.

[14] Wei L, Ma F, Wang XY, et al. Influence of different 16S rDNA target sequence on analysis of microbial diversity in anaerobic ABR reactor. Chin J Envir Sci, 2008, 29(3): 776?780 (in Chinese).魏利, 馬放, 王欣宇, 等. 基于16S rDNA不同靶序列對(duì)厭氧ABR反應(yīng)器微生物多樣性分析的影響. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(3): 776?780.

[15] Michael KR. Production of acetic acid from waste biomass [D]. Colledge Station: Texas A&M University, 1998.

[16] Steed J, Hashimoto AG. Methane emissions from typical manure management systems. Bioresour Technol, 1994, 50: 123?130.

[17] Leaphart AB, Friez MJ, Lovell CR. Formyltetrahydrofolate synthetase sequences from salt marsh plant roots reveal a diversity of acetogenic bacteria and other bacterial functional groups. Appl Environ Microbiol, 2003, 69: 693?696.

[18] Drake HL, G??ner AS, Daniel SL. Old acetogens, New light. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1125(1): 100?128.

[19] Drake HL, Küsel K, Matthies C. The Prokaryotes. New York: Springer, 2006: 354?420.

[20] Cotter JL, Chinn MS, Grunden AM. Influence of process parameters on growth of Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum on synthesis gas. Enzyme Microb Technol, 2009, 44: 281?288.

[21] Younesi H, Najafpour G, Mohamed AR. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljungdahlii. Biochem Eng J, 2005, 27: 110?119.

[22] Kamlage B, Gruhl B, Blaut M. Isolation and characterization of two new homoacetogenic hydrogen-utilizing bacteria from the human intestinal tract that are closely related to Clostridium coccoides. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(5): 1732.

[23] Allen TD, Caldwell ME, Lawson PA, et al. Alkalibaculum bacchi gen. nov., sp. nov., a CO-oxidizing, ethanol-producing acetogen isolated from livestock-impacted soil. Int J Syst Evol Micr, 2010, 60: 2483?2489.

[24] Guo Y, Xu JL, Zhang Y, et al. Medium optimization for ethanol production with Clostridium autoethanogenum with carbon monoxide as sole carbon source. Bioresour Technol, 2010, 101: 8784?8789.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Screening of homoacetogen mixed culture converting H2/CO2to acetate

Kan Luo, Bo Fu, Lijuan Zhang, Hongbo Liu, and He Liu
Laboratory of Environmental Biotechnology, School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Homoacetogens are a group of microorganisms with application potential to produce chemicals and biofuels by the bioconversion of synthesis gas. In this study, we collected waste activated sludge samples to screen homoacetogens by Hungate anaerobic technique, and studied the effect of pH on acetate and alcohol production from H2/CO2gas. The mixed culture contained Clostridium ljungdahlii, Lysinibacillus fusiformis and Bacillus cereus. Acetate concentration achieved 31.69 mmol/L when the initial pH was 7. The mixed culture containing homoacetogen could converting H2/CO2to acetate, which provides an efficient microbial resource for the bioconversion of synthesis gas.

March 21, 2014; Accepted: April 11, 2014

He Liu. Tel/Fax: +86-510-85326670; E-mail: liuhe@jiangnan.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21206056) , Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2012121).

國家自然科學(xué)基金 (No. 21206056)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK2012121) 資助。