有機碳源下廢水厭氧氨氧化同步脫氮除碳

陳重軍，朱為靜，黃孝肖，吳偉祥

1 浙江大學環(huán)境與資源學院, 浙江 杭州 310058

2 蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009

研究報告

有機碳源下廢水厭氧氨氧化同步脫氮除碳

陳重軍1,2，朱為靜1，黃孝肖1，吳偉祥1

1 浙江大學環(huán)境與資源學院, 浙江 杭州 310058

2 蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009

陳重軍, 朱為靜, 黃孝肖, 等. 有機碳源下廢水厭氧氨氧化同步脫氮除碳. 生物工程學報, 2014, 30(12):1835?1844.

Chen CJ, Zhu WJ, Huang XX, et al. Simultaneous removal of carbon and nitrogen from organic-rich wastewater with anammox. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1835?1844.

為明確有機碳源脅迫下，厭氧氨氧化反應器的同步脫氮除碳規(guī)律及功能微生物群落結構的動態(tài)變化，采用成功啟動的厭氧氨氧化UASB反應器，通過逐步提升進水有機負荷，探究有機碳源下廢水厭氧氨氧化同步脫氮除碳。研究表明，當進水化學需氧量 (Chemical oxygen demand, COD) 濃度從172 mg/L升至620 mg/L，反應器維持較高的脫氮效率，氨氮和總氮去除率均在85%以上，并對COD具有平均56.6%的去除率，高濃度COD未對Anammox菌活性構成顯著抑制作用。聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE) 圖譜和割膠測序結果表明，變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、綠曲撓菌門Chloroflexi以及綠菌門Chlorobi等微生物共存于同一反應體系中，推測反應器內(nèi)存在復雜的脫氮除碳途徑。而且，代表厭氧氨氧化的部分浮霉菌門微生物能耐受高濃度有機碳源，在高有機負荷下依舊發(fā)揮著高效的脫氮作用，為反應器高效脫氮提供了保障。

厭氧氨氧化，有機碳源，脫氮除碳，聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳

厭氧氨氧化 (Anaerobic Ammonium Oxidation，Anammox) 反應是指在厭氧或缺氧條件下，Anammox菌以NO2--N 為電子受體，氧化NH4+-N 為N2的生物過程，該過程不需有機碳源，可實現(xiàn)全程自養(yǎng)脫氮，已成為廢水脫氮領域的研究熱點[1-2]。然而，自養(yǎng)型Anammox菌生長速率低，倍增時間長，且實際廢水中存在的有機物對Anammox菌有顯著抑制作用[3-4]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Anammox菌與反硝化菌能共存于同一反應體系中，有機物含量相對較低 (一般COD濃度低于100 mg/L) 時能夠有效避免反硝化菌的大量繁殖[5]，且兩者形成一定的協(xié)同作用[6]。但在實際廢水中，COD濃度大多數(shù)超過100 mg/L。存在高濃度有機物時，厭氧氨氧化反應器能否繼續(xù)發(fā)揮脫氮作用？Anammox菌是否會受到抑制？上述問題均有待研究。

本文擬在高有機物濃度下，明確厭氧氨氧化反應器脫氮除碳性能及污染物去除規(guī)律，并初步探索反應器運行過程中功能性微生物群落結構的變化情況，以期為厭氧氨氧化反應的工程化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 反應裝置

反應裝置采用上流式厭氧污泥床反應器(Up-flow anaerobic sludge bed/blanket，UASB)，由PVC材料制作而成，上部直徑20 cm，下部直徑10 cm，高度100 cm，高徑比10∶1，有效容積10.8 L，上部設三相分離器用于氣液固分離，氣孔用水封以保證反應器內(nèi)部厭氧，進水采用蠕動泵控制 (圖1)。反應器外部設置厚度為1 cm的加熱保溫層，維持反應器溫度(30±1)℃，為Anammox菌提供合適的生長環(huán)境[7]。反應器內(nèi)添加低溫制成的竹炭 (Bamboo charcoal) 為填料，竹炭具有巨大的比表面積(2.5×108m2/m3) 和大量的微孔結構 (直徑介于0.001–1 000 μm)，可以為Anammox菌的生長提供適宜場所，接種厭氧污泥后，經(jīng)過65 d成功啟動厭氧氨氧化，反應器穩(wěn)定運行后Anammox菌占總細菌比例為43.7%[8]。

1.2 廢水來源與進水濃度

廢水取自浙江省杭州市某溫室甲魚養(yǎng)殖公司，養(yǎng)殖廢水水質：pH 值7.5?8.1, SS 800?1 000 mg/L，COD 529?624 mg/L，NH4+-N 132?140 mg/L，TN 138?145 mg/L, 其中NO3--N和NO2--N＜2 mg/L，NH4+-N是TN的主要賦存形式。根據(jù)厭氧氨氧化反應式，實際廢水經(jīng)稀釋后添加NaNO2，使進水NO2--N/NH4+-N在0.98?1.10之間，并添加微量元素Ⅰ和Ⅱ，進水C/N比為1.76?2.09。隨著試驗推進，稀釋比逐漸降低，有機負荷依次升高，最終進水未經(jīng)稀釋，根據(jù)進水水質差異，將反應過程分為5個階段，各階段進水水質見表1。反應器運行時間共計77 d，水力停留時間 (HRT) 控制為12 h。

1.3 分析方法

1.3.1 水質分析

每天采取反應器進出水，分別測定COD (重鉻酸鉀法)、NH4+-N (納氏比色法)、NO3--N (紫外分光光度法)、NO2--N (N-(1-萘基)-乙二胺光度法)、TN (堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法)等指標，每個指標測定設2個重復，取平均值[9]。

1.3.2 PCR擴增

圖1 厭氧氨氧化試驗裝置Fig. 1 Experimental Set-up for Anammox.

表1 各階段反應器進水水質特征Table 1 Characteristics of influent wastewater in different phase

在試驗過程中，采取反應器第0天、第45天和第77天的生物膜樣品，提取DNA，進行PCR-DGGE分析。PCR采用細菌F357GC (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C CC TAC GGG AGG CAG CAG -3') 和R518 (5'- ATT ACC GCG GCT GCT GG -3') 引物對[10]。引物一端加上GC夾，保證DGGE試驗的穩(wěn)定和片段的分離。

PCR采用50 μL反應體系：10×反應緩沖液體 (0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.3)，0.5 mol/L KCl) 5 μL；MgCl2(25 mmol/L) 6 μL；F357GC (25 pmol/μL) 和R518 (25 pmol/μL) 各1 μL；dNTPs (各2.5 mmol/L) 4 μL；Taq酶 (5 U/μL，TaKaRa) 0.3 μL；模板DNA 2 μL；ddWater 30.7 μL。PCR反應分6個步驟：①預變性94 ℃4 min；②變性94 ℃ 30 s；③退火56 ℃ 40 s；④延伸72 ℃ 1 min ；循環(huán)第②–④步驟35次；⑤延伸72 ℃ 10 min ；⑥保持4 ℃。

1.3.3 變性梯度凝膠電泳 (DGGE)

DGGE分析采用8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為30%?60%。待變性膠完全凝固后，將膠版放入裝有電泳緩沖液 (1×TAE) 的裝置中，每個加樣孔加入含有15 μL 6×溴酚藍二甲苯氰溶液的PCR樣品40?50 μL。電泳采用Dcode DGGE系統(tǒng) (BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA，USA)，在60 ℃，85 V電壓下，電泳16 h。電泳后，膠采用生物色素 (SYBR) 染色 (SYBR 3 μL：1×TAE 15 mL) 30 min，采用凝膠成像系統(tǒng) (Gel DocTMEQ，Biorad) 成像[11]。對DGGE膠上的條帶進行割膠回收，割得的膠條，經(jīng)克隆、連接和轉化后，將陽性克隆的菌液送往華大基因 (杭州) 測序。

1.3.4 Shannon指數(shù)計算

利用Quantity One 4.4 (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA) 軟件將DGGE圖譜轉化為相應的數(shù)字信號，對試驗各階段的微生物群落多樣性指數(shù)Sharon指數(shù)H'進行了分析，公式為[12]：

其中：ni為峰高，N為所有峰的總峰高。

2 結果與討論

2.1 水質動態(tài)變化分析

在不同有機負荷下，研究了厭氧氨氧化反應器的脫氮性能，結果表明，不同濃度COD脅迫下反應器的脫氮效率穩(wěn)定保持在較高水平(圖2和圖3)。根據(jù)進水濃度及C/N比不同，整個試驗過程分為5個階段。在整個過程中，反應器出水NO2--N濃度穩(wěn)定保持在1 mg/L以下。出水氨氮濃度有一定的波動。在第1和第2階段，出水NH4+-N濃度較低，分別為 (3.1 ± 1.3) mg/L和 (3.4 ± 2.9) mg/L。至第3階段，出水NH4+-N有所升高，最高達到31.8 mg/L，主要原因為進水底物NO2--N/NH4+-N較低 (0.87?0.88)，不足以滿足Anammox反應對底物化學計量比的需求 (理論值NO2--N/NH4+-N約1.3)，NH4+-N過量，導致反應器NH4+-N去除率驟降[7]。從第29天開始，當調(diào)整進水NO2--N與NH4+-N化學計量比為1.06–1.15，出水NH4+-N濃度逐漸降低至 (4.8±1.6) mg/L。第4和第5階段，當進水NH4+-N濃度提升至108.4?139.8 mg/L，出水NH4+-N濃度驟升至20.0 mg/L，經(jīng)過一段時間馴化，后逐步穩(wěn)定至 (13.4 ± 1.1) mg/L。由結果可知，進水底物濃度和反應化學計量比是影響厭氧氨氧化脫氮效率的重要因素。厭氧氨氧化反應會生成約10%的NO3--N，然而運行過程中，僅前8 d在出水中檢測到NO3--N，推測在反應器中存在反硝化作用，即在厭氧條件下，反硝化菌以NO2--N和NO3--N為電子受體，有機物為電子供體，生成N2[13]。反硝化作用的存在為反應器深度脫氮和除碳作用提供了良好的基礎。

反應器對NO2--N和NH4+-N的穩(wěn)定高效去除，使得TN去除率穩(wěn)定保持在85%以上 (圖2和圖3)。在第1和2階段，TN去除率從79.2%快速升高至98.8%，之后保持穩(wěn)定且較高的去除率；在第3階段初期，受出水NH4+-N濃度影響，TN去除率急劇降低至82.2%，后緩慢恢復至98.1%。進入第4和5階段，TN去除率緩慢降低，到試驗末期去除率降至88.9%。TN與NH4+-N的去除規(guī)律基本一致。

圖2 各階段反應器進出水氮素的變化趨勢Fig. 2 Time courses of influent and effluent nitrogen concentrations in reactor.

圖3 反應器氮素去除率隨時間變化趨勢Fig. 3 Time courses of nitrogen removal efficiency in reactor.

在整個運行過程中，反應器對COD的去除率為 (56.6 ± 11.0) % (圖4)。在第1階段初期，隨著氮素去除率的提升，COD去除率也急速上升，從50.0%升至78.7%，之后到第2階段末期，COD去除率均維持在60%以上，而在第3階段初期，急劇降低至30.6%，與氮素去除“低谷”基本一致；隨后去除率緩慢上升，到第4和5階段，COD基本維持在55%?60%之間。在整個過程中，雖然進水COD濃度從172 mg/L上升至620 mg/L，有機負荷逐步提升，但是COD去除率較為穩(wěn)定，只有在第3階段初期，出現(xiàn)COD去除“低谷”。COD與氮素去除“低谷”的高度一致性，也間接表明COD去除與厭氧氨氧化生成的NO3--N型反硝化作用存在關聯(lián)。

研究表明，Anammox菌是自養(yǎng)菌，生長率低，倍增時間長，在高濃度COD環(huán)境下，反硝化菌快速增殖，其生長率遠高于Anammox菌，因此高濃度COD會部分抑制或者完全抑制Anammox菌活性[14-15]。但在本研究中，高濃度COD并未抑制Anammox菌活性，反應器對氮素的去除率一直維持在85%以上，且NH4+-N和NO2--N能夠同步穩(wěn)定高效去除。本研究的進水COD濃度遠高于文獻報道的COD抑制濃度，一般為237?300 mg/L[15]；而且進水C/N比在1.81?2.13之間，也高于文獻報道的抑制性C/N比 (大于1)[16]。有研究表明，亞硝化-厭氧氨氧化工藝可成功用于豬場廢水處理，高濃度有機物對厭氧氨氧化效能的影響并不明顯[17]?？傊?，在研究中，高濃度COD (高達620 mg/L) 并未對Anammox菌活性產(chǎn)生明顯的抑制效應，NH4+-N、NO3--N、NO2--N和COD能穩(wěn)定同步去除，有關機理有待深入研究。

2.2 生物膜群落結構分析

2.2.1 形態(tài)和結構

圖4 各階段反應器進出水COD濃度與去除率隨時間變化情況Fig. 4 Time courses of influent and effluent COD concentrations and removal efficiency in reactor.

因富集培養(yǎng)Anammox菌超過1年，填料表面生物膜與反應液均呈現(xiàn)紅色，這是Anammox菌含有較高的血紅素c所致[7]。在泵入高濃度有機廢水后，生物膜顏色逐漸轉變?yōu)樽厣?，之后顏色加深，最后變?yōu)楹谏?，推測這是有機物導致硫化物 (如硫化亞鐵) 形成所致[15]。從填料表面生物膜特性看，有機物脅迫之前，生物膜致密、均勻、顏色鮮亮；有機物脅迫之后，生物膜變得稀疏、膜生物量減少、顏色變淡；最后，生物膜量回升，但顏色變?yōu)楹诤稚?(圖5)。

圖5 反應器生物膜和污泥外觀變化情況 (從左到右依次為第1天和第77天樣品)Fig. 5 The appearance of biofilm and sludge in reactor (from left to right the 1st and the 77th days' sample).

2.2.2 微生物群落結構分析

有機物影響下污泥中總細菌多樣性的DGGE分析結果見圖6。按照每個條帶的強度，分析反應器各階段樣品的細菌多樣性，在第0天、第45天和第77天的Shannon指數(shù) (H′) 分別為3.03±0.03、3.11±0.03和3.02±0.04。以亮度較高的DGGE條帶或各時期存在差異性的條帶 (只存在于某一個或兩個時期) 為對象，選擇了13個特異性條帶。3個時期的條帶數(shù)量分別為6條、7條和12條，表明各時期微生物多樣性存在差異。泵入高濃度有機廢水后，條帶數(shù)目有所增加，但條帶位置和亮度發(fā)生動態(tài)變化，可分為兩類情況：1) 亮度減弱條帶：1、2、3、5、6號條帶逐漸減弱，其中1、2號條帶“先消失后再現(xiàn)”，3、5、6條帶逐漸減弱，而5號條帶最后消失，3和6號條帶一直存在；2) 亮度增強條帶：4、7、8、9、10、11、12、13號條帶亮度逐漸增強，且4、9號條帶亮度明顯增強。各時期DGGE條帶數(shù)量和位置的變化，表明反應器內(nèi)微生物群落結構發(fā)生了動態(tài)變化，但從H′指數(shù)變化看，微生物群落豐度變化并不明顯。雖然在第45天，總細菌多樣性有所增高，但之后降低至初始水平。在高濃度有機物脅迫下，反應器內(nèi)微生物群落多樣性變化不明顯，造成該結果的原因可能是竹炭填料在一定程度上緩解了高濃度有機廢水對反應器細菌群落結構的沖擊[18]。

在DGGE圖譜上選取13條條帶進行了割膠回收和16S rRNA基因測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列的比對結果見表2。

圖6 PCR-DGGE圖譜分析Fig. 6 The PCR-DGGE analysis.

表2 DGGE條帶測序比對結果Table 2 Results of the best march to known species of the clones

在回收測序的13個克隆子中，其中第5和6號條帶對應的克隆子屬于浮霉菌門Planctomycetes；第4、8和13號條帶對應的克隆子屬于變形菌門Proteobacteria；第7和10條帶對應的克隆子屬于綠菌門Chlorobi；第2號條帶對應的克隆子屬于綠曲撓菌門Chloroflexi；其余的5個克隆在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有找到相近的已知物種，未得到詳細分類信息。在已知分類信息的克隆中，變形菌門占37.5%，浮霉菌門占25.0%，綠曲撓菌門12.5%，綠菌門占25.0%。反應器內(nèi)微生物種群的分布與其他報道基本一致，Bae等研究了厭氧氨氧化UASB反應器中的微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)主要為變形菌門(42%)，浮霉菌門 (20%)，綠曲撓菌門 (22%)，其他菌 (9%)[19]。

在浮酶菌門中，第5號條帶屬于“Candidatus Brocadia”屬，最早發(fā)現(xiàn)于荷蘭污水處理廠污泥中[20-21]，是第一個被富集鑒定的Anammox菌種。第6號條帶未指向特定的種。第8號條帶為反硝化菌屬，推測與反硝化作用有關。第4和13號條帶未指向特定的種。第2號條帶為綠曲撓菌門，該菌在富集程度較高的Anammox污泥中較為普遍，如厭氧氨氧化序批式生物膜反應器 (SBBR)、上升式厭氧顆粒床反應器、全程自養(yǎng)脫氮反應器 (CANON) 等[22-24]，其作用是固碳，將CO2固定為最終產(chǎn)物丙酮酸。綠菌門是一類進行不產(chǎn)氧光合作用的細菌，常在Anammox反應器中被檢測到[25]。但其在厭氧氨氧化反應中起什么作用還不得而知。

在整個試驗過程中，已知分類地位的變形菌門和浮霉菌門占62.5%，該兩類菌分別代表了反硝化微生物和厭氧氨氧化微生物，可知在有機廢水處理系統(tǒng)中，反硝化菌和Anammox菌可共存于反應體系中，這也是廢水中碳氮能夠同步被去除的重要佐證。但是，隨著有機物的脅迫，反硝化菌和Anammox菌存在動態(tài)變化，其中4、8和13號條帶代表的反硝化菌逐漸增強，而5和6號條帶代表的Anammox菌逐漸減弱，5號條帶一度消失。值得一提的是，當進水COD濃度從172 mg/L升至620 mg/L，部分Anammox菌如條帶6，雖然條帶濃度有所減弱，但一直存在于反應體系中，可以耐受高濃度的有機碳源，為厭氧氨氧化反應維持主導作用起到關鍵作用，但其耐受高濃度有機碳源的具體原因和機制還有待分析。

3 結論

采用成功啟動厭氧氨氧化的UASB反應器處理高濃度有機碳源的廢水，COD濃度從172 mg/L升至620 mg/L，在較高有機負荷脅迫下反應器依舊表現(xiàn)出良好的碳氮去除能力，對NH4+-N和TN去除率均在85%以上，COD平均去除率56.6%，表明高濃度COD未對Anammox菌活性構成顯著性抑制作用。通過PCR-DGGE和割膠測序分析技術表明，反應器中的微生物主要屬于變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、綠曲撓菌門Chloroflexi以及綠菌門Chlorobi，同時發(fā)現(xiàn)部分浮霉菌門微生物能耐受高濃度有機碳源，具體原因值得進一步研究證實。

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(本文責編 陳宏宇)

Simultaneous removal of carbon and nitrogen from organic-rich wastewater with Anammox

Chongjun Chen1,2, Weijing Zhu1, Xiaoxiao Huang1, and Weixiang Wu1
1 College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China
2 School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China

In order to simultaneously remove carbon and nitrogen from organic-rich wastewater, we used an up-flow anaerobic sludge bed/blanket (UASB) reactor that was started up with anammox with high concentration of carbon and nitrogen by gradually raising the organic loading of influent. We optimized the removal of nitrogen and carbon when thechemical oxygen demand (COD) concentration varied from 172 to 620 mg/L. During the entire experiment, the ammonium and total nitrogen removal efficiency was higher than 85%, while the average COD removal efficiency was 56.6%. The high concentration of organic matter did not restrain the activity of anammox bacteria. Based on polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) and tapping sequencing analyses, the Planctomycete, Proteobacteria, Chloroflexi, Chlorobi bacteria are detected in the UASB reactor, which indicated complex removal pathway of carbon and nitrogen coexisted in the reactor. However, a part of Planctomycete which referred to anammox bacteria could tolerate a high content of organic carbon, and it provided help for high performance of nitrogen removal in UASB reactor.

Anammox, carbon resource, simultaneous carbon and nitrogen removal, polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)

March 13, 2014; Accepted: April 25, 2014

Weixiang Wu. Tel/Fax: +86-571-88982020; E-mail: weixiang@zju.edu.cn

Supported by: China National Critical Project for Science and Technology on Water Pollution Prevention and Control (No. 2012ZX07101012), Natural Science Funds of Suzhou University of Science and Technology (No. XKQ201303), Science and Technology Project of Jiangsu Construction Department (No. 2013ZD35).

國家水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2014ZX07101-012)，蘇州科技學院科研基金 (No. XKQ201303), 江蘇省建設系統(tǒng)科技項目 (No. 2013ZD35)資助。

Received: March 13, 2014; Accepted: April 25, 2014

Supported by: China National Critical Project for Science and Technology on Water Pollution Prevention and Control (No. 2012ZX07101012), Natural Science Funds of Suzhou University of Science and Technology (No. XKQ201303), Science and Technology Project of Jiangsu Construction Department (No. 2013ZD35).

Corresponding author: Weixiang Wu. Tel/Fax: +86-571-88982020; E-mail: weixiang@zju.edu.cn

國家水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2014ZX07101-012)，蘇州科技學院科研基金 (No. XKQ201303), 江蘇省建設系統(tǒng)科技項目 (No. 2013ZD35)資助。

Received: March 13, 2014; Accepted: April 25, 2014

Supported by: China National Critical Project for Science and Technology on Water Pollution Prevention and Control (No. 2012ZX07101012), Natural Science Funds of Suzhou University of Science and Technology (No. XKQ201303), Science and Technology Project of Jiangsu Construction Department (No. 2013ZD35).

Corresponding author: Weixiang Wu. Tel/Fax: +86-571-88982020; E-mail: weixiang@zju.edu.cn

國家水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2014ZX07101-012)，蘇州科技學院科研基金 (No. XKQ201303), 江蘇省建設系統(tǒng)科技項目 (No. 2013ZD35)資助。