環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌

張濤濤+王蘭+龔頻+陳福欣

摘要：研究了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。首先根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc中的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立并優(yōu)化反應(yīng)條件，然后通過對(duì)金黃色葡萄球菌及其他菌種的對(duì)比試驗(yàn)，驗(yàn)證引物的特異性并確定方法的檢測(cè)限。結(jié)果表明：在用加環(huán)引物的條件下，LAMP反應(yīng)體系于60 ℃反應(yīng) 35 min 即可擴(kuò)增成功，而用未加環(huán)的引物則需45 min才能看到白色絮狀沉淀。對(duì)2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌、1株沙門氏菌進(jìn)行同步檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株金黃色葡萄球菌均顯示陽性，而其他菌株均顯示陰性。研究確定了LAMP檢測(cè)純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限為100 fg，比PCR的最低檢測(cè)限低2個(gè)數(shù)量級(jí)。由研究結(jié)果可以看出，LAMP法檢測(cè)金黃色葡萄球菌操作簡(jiǎn)便，有較高的特異性、靈敏度，為快速檢測(cè)食品中的致病菌提供了較好的技術(shù)平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；金黃色葡萄球菌；耐熱核酸酶基因nuc；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0238-03

收稿日期：2013-06-27

項(xiàng)目基金：陜西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2012JQ2011）；陜西省教育廳自然科學(xué)基金（編號(hào)：12JK0712、12JK0623）；西安市未央?yún)^(qū)項(xiàng)目（編號(hào)：201112、201209）。

作者簡(jiǎn)介：張濤濤（1984—），女，山西孝義人，碩士研究生，主要從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究。E-mail：ztt2008523220302@126.com。

通信作者：王蘭，女，教授，主要從事藥物與功能性食品研究工作。E-mail：wanglan1963@126.com。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中的三大致病菌之一[1]，在自然界中廣泛存在。隨著抗生素的廣泛使用，出現(xiàn)了大量的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，這些金黃色葡萄球菌均可以產(chǎn)生導(dǎo)致人們食物中毒的SEs、TSST等毒力因子[2]。據(jù)美國疾病控制中心顯示，美國在近年來由于金黃色葡萄球菌而導(dǎo)致的食品中毒事件占33%，居世界第二位[3]，而我國由金黃色葡萄球菌引起的食品中毒事件更是屢見不鮮。

目前我國對(duì)于金黃色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法以微生物培養(yǎng)法為主，但其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)不高；而傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，如PCR、實(shí)時(shí)PCR及鏈置換擴(kuò)增法等，雖然檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短，但在實(shí)際操作中仍然存在儀器昂貴、誤差大等諸多缺陷[4]，從而限制了這些傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在基層的廣泛推廣。因此，目前亟需建立一種高效、快速且特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種由日本科學(xué)家Notomi開發(fā)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是在Bst酶作用下進(jìn)行的一種自動(dòng)式鏈置換合成DNA的反應(yīng)[5]。LAMP法在65 ℃左右的恒溫條件下反應(yīng)約50 min即可明顯觀察到白色絮狀沉淀，相比PCR技術(shù)，無需DNA變性，不需要長(zhǎng)時(shí)間的熱循環(huán)及電泳檢測(cè)，是一種高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高的分子檢測(cè)技術(shù)。張琳等將LAMP結(jié)合熒光技術(shù)應(yīng)用于IBV病毒檢測(cè)[6]，李永剛等對(duì)金黃色葡萄球菌的產(chǎn)腸毒素基因fem進(jìn)行了檢測(cè)[7]，唐夢(mèng)君等以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因作為靶基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，即外引物、內(nèi)引物[8]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，即外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化，并進(jìn)行引物的特異性鑒定及檢測(cè)限的確定。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

主要儀器有PCR擴(kuò)增儀（MJ Research），凝膠成像系統(tǒng)，冷凍高速離心機(jī)，DDC-10C型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），水浴鍋等。

主要生化試劑有Bst聚合酶，Taq聚合酶，dNTPs，DNA marker等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇購自天津天力化學(xué)試劑有限公司；培養(yǎng)基牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC14458）、釀膿鏈球菌（ATCC19615）、沙門氏菌（ATCC14028）由中國普通微生物菌種保藏中心提供；金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC35218）由中國藥品生物制品檢定所提供；大腸桿菌（CMCC44752）由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供；大腸桿菌（O157：H7）為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因的保守序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explore 3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，篩選得到一套引物，包括外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物，詳見表1。設(shè)計(jì)完成后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4DNA的提取

1.5LAMP擴(kuò)增及條件的優(yōu)化

1.6LAMP特異性試驗(yàn)

本試驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌（ATCC14458）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC35218）、大腸桿菌（CMCC44752）、大腸桿菌（O157：H7）、釀膿鏈球菌（ATCC19615）、沙門氏菌（ATCC14028）作為L(zhǎng)AMP研究對(duì)象，用以評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌nuc基因引物的特異性。

1.7LAMP靈敏度試驗(yàn)

將本試驗(yàn)提取的金黃色葡萄球菌（ATCC14458）DNA用生理鹽水稀釋10倍及以上，并用蒸餾水作為陰性對(duì)照，觀察LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限。

2結(jié)果與分析endprint

2.1LAMP檢測(cè)結(jié)果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)，其擴(kuò)增結(jié)果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對(duì)照未出現(xiàn)梯狀條帶。另外發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增完成并且離心后，EP管底部出現(xiàn)白色沉淀，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)白色沉淀。

2.2LAMP檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1LAMP反應(yīng)溫度應(yīng)用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)化。如圖2所示，泳道

5、7出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴(kuò)增成功，說明該反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應(yīng)時(shí)間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增有影響，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為35 min時(shí)即開始擴(kuò)增，且在45 min時(shí)出現(xiàn)了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環(huán)引物與否并不影響LAMP 的成功擴(kuò)增，但是加入環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增速率明顯比未加環(huán)引物的擴(kuò)增速率高（表1），加環(huán)引物的擴(kuò)增只需 35 min，而未加環(huán)引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環(huán)引物能加快LAMP的反應(yīng)速率。

2.3LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用上述試驗(yàn)建立并優(yōu)化的LAMP反應(yīng)條件，針對(duì)2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗(yàn)中根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結(jié)果表明：陰性對(duì)照沒有梯狀條帶出現(xiàn)，且LAMP檢測(cè)的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測(cè)限。

3結(jié)論

引物設(shè)計(jì)是LAMP法的關(guān)鍵，若引物質(zhì)量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據(jù)該基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，增加了擴(kuò)增的特異性。針對(duì)所檢測(cè)的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設(shè)計(jì)的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環(huán)境下反應(yīng)，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗(yàn)中，60 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時(shí)，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時(shí)，酶的活性已經(jīng)失去，因此未能擴(kuò)增成功。

對(duì)于反應(yīng)中加入環(huán)引物與未加環(huán)引物的研究，由本試驗(yàn)可知：加入環(huán)引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環(huán)引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環(huán)引物的比未加環(huán)引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環(huán)引物可以使反應(yīng)時(shí)間縮短30%～50%的結(jié)果[12]一致。

LAMP是一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確、靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，但是在國內(nèi)較少應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術(shù)會(huì)很快普及到食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

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[9]歐新華，張如勝，宋克云，等. 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)甲型H1N1流感病毒[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（5）：443-445.

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[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP檢測(cè)結(jié)果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)，其擴(kuò)增結(jié)果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對(duì)照未出現(xiàn)梯狀條帶。另外發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增完成并且離心后，EP管底部出現(xiàn)白色沉淀，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)白色沉淀。

2.2LAMP檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1LAMP反應(yīng)溫度應(yīng)用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)化。如圖2所示，泳道

5、7出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴(kuò)增成功，說明該反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應(yīng)時(shí)間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增有影響，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為35 min時(shí)即開始擴(kuò)增，且在45 min時(shí)出現(xiàn)了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環(huán)引物與否并不影響LAMP 的成功擴(kuò)增，但是加入環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增速率明顯比未加環(huán)引物的擴(kuò)增速率高（表1），加環(huán)引物的擴(kuò)增只需 35 min，而未加環(huán)引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環(huán)引物能加快LAMP的反應(yīng)速率。

2.3LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用上述試驗(yàn)建立并優(yōu)化的LAMP反應(yīng)條件，針對(duì)2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗(yàn)中根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結(jié)果表明：陰性對(duì)照沒有梯狀條帶出現(xiàn)，且LAMP檢測(cè)的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測(cè)限。

3結(jié)論

引物設(shè)計(jì)是LAMP法的關(guān)鍵，若引物質(zhì)量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據(jù)該基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，增加了擴(kuò)增的特異性。針對(duì)所檢測(cè)的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設(shè)計(jì)的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環(huán)境下反應(yīng)，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗(yàn)中，60 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時(shí)，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時(shí)，酶的活性已經(jīng)失去，因此未能擴(kuò)增成功。

對(duì)于反應(yīng)中加入環(huán)引物與未加環(huán)引物的研究，由本試驗(yàn)可知：加入環(huán)引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環(huán)引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環(huán)引物的比未加環(huán)引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環(huán)引物可以使反應(yīng)時(shí)間縮短30%～50%的結(jié)果[12]一致。

LAMP是一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確、靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，但是在國內(nèi)較少應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術(shù)會(huì)很快普及到食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

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[11]梁磊. 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛肉中大腸桿菌O157的研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP檢測(cè)結(jié)果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)，其擴(kuò)增結(jié)果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對(duì)照未出現(xiàn)梯狀條帶。另外發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增完成并且離心后，EP管底部出現(xiàn)白色沉淀，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)白色沉淀。

2.2LAMP檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1LAMP反應(yīng)溫度應(yīng)用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)化。如圖2所示，泳道

5、7出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴(kuò)增成功，說明該反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應(yīng)時(shí)間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增有影響，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為35 min時(shí)即開始擴(kuò)增，且在45 min時(shí)出現(xiàn)了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環(huán)引物與否并不影響LAMP 的成功擴(kuò)增，但是加入環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增速率明顯比未加環(huán)引物的擴(kuò)增速率高（表1），加環(huán)引物的擴(kuò)增只需 35 min，而未加環(huán)引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環(huán)引物能加快LAMP的反應(yīng)速率。

2.3LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用上述試驗(yàn)建立并優(yōu)化的LAMP反應(yīng)條件，針對(duì)2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗(yàn)中根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結(jié)果表明：陰性對(duì)照沒有梯狀條帶出現(xiàn)，且LAMP檢測(cè)的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測(cè)限。

3結(jié)論

引物設(shè)計(jì)是LAMP法的關(guān)鍵，若引物質(zhì)量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據(jù)該基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，增加了擴(kuò)增的特異性。針對(duì)所檢測(cè)的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設(shè)計(jì)的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環(huán)境下反應(yīng)，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗(yàn)中，60 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時(shí)，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時(shí)，酶的活性已經(jīng)失去，因此未能擴(kuò)增成功。

對(duì)于反應(yīng)中加入環(huán)引物與未加環(huán)引物的研究，由本試驗(yàn)可知：加入環(huán)引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環(huán)引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環(huán)引物的比未加環(huán)引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環(huán)引物可以使反應(yīng)時(shí)間縮短30%～50%的結(jié)果[12]一致。

LAMP是一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確、靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，但是在國內(nèi)較少應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術(shù)會(huì)很快普及到食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

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