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    補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響

    2014-07-18 11:53:10趙宗江張新雪張豐豐程明秀王穎超吳志奎
    世界中醫(yī)藥 2014年6期
    關鍵詞:紅系生血含藥

    田 晨 趙宗江 張新雪 張豐豐 程明秀 王穎超 趙 敬 吳志奎

    (1 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院細胞與生化實驗室,北京,100029; 2 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院,北京,100053)

    補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響

    田 晨1趙宗江1張新雪1張豐豐1程明秀1王穎超1趙 敬1吳志奎2

    (1 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院細胞與生化實驗室,北京,100029; 2 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院,北京,100053)

    目的:探討補腎益髓生血法再生障礙性貧血(Aplastic Anemia,AA,簡稱再障)大鼠含藥血清對大鼠骨髓造血干細胞紅系分化JAK2/STAT5信號通路的影響。方法:在前期整體動物實驗的基礎上,體外培養(yǎng)正常大鼠造血干細胞,誘導其定向紅系分化,分為空白對照組、正常對照組、模型組、司坦唑醇組(康力龍組)、益髓生血組、溫腎生血組和滋腎生血組,在培養(yǎng)體系中加入含藥血清干預4d后,提取紅系細胞總RNA及蛋白,分別采用RT-PCR和Western blot檢測細胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達情況。結果:與正常對照組相比,模型組細胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達均明顯降低(P<0.01);與模型組相比,各治療組JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.01或P<0.05);滋腎生血組JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達高于益髓生血組和溫腎生血組(P<0.05)。結論:補腎益髓生血法能夠增強JAK2、STAT5的表達,可能通過影響JAK2/STAT5信號通路來促進紅系細胞的分化成熟,其中滋腎生血法優(yōu)于益髓生血法和溫腎生血法。

    補腎益髓生血法;再障;造血干細胞;紅系分化;JAK2/STAT5信號通路

    再生障礙性貧血(Aplastic Anemia,AA,簡稱再障)是骨髓造血功能衰竭性疾病,臨床癥狀以貧血、出血、感染為主。屬于中醫(yī)“血虛”“髓勞”等范疇,其基本病機在于腎虛,腎不藏精,生髓,化血[1],貧血的發(fā)生主要是由于紅系發(fā)育異常,導致成熟紅細胞減少,血紅蛋白濃度降低。EPO是促進紅細胞分化成熟最為主要的細胞因子,EPO與紅系祖細胞表面的EPOR結合后,可以啟動JAK2/STAT5信號轉導途徑,引起基因轉錄增強或抑制,最終導致紅系細胞的增殖和分化[2]。補腎益髓生血法是針對AA的基本病機,根據中醫(yī)“腎藏精,生髓化血”理論結合臨床實踐確立的治療AA大法。該法可以明顯改善患者的貧血癥狀[3],增加紅系祖細胞數目[4],提升紅細胞水平,但其作用機制的研究有待進一步研究,因此,本研究在前期整體動物實驗的基礎上,體外培養(yǎng)造血干細胞并誘導其向紅系分化,觀察補腎益髓生血法再障大鼠含藥血清對正常大鼠骨髓造血干細胞紅系分化過程中JAK2/STAT5信號通路的影響。

    1 材料

    1.1 細胞 正常大鼠骨髓單個核細胞,SD大鼠,體重(200±20)g。

    1.2 主要試劑 IMDM(Gibco,批號:12200036),大鼠外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋,批號:LTS1083),干細胞因子(SCF,PeproTech,批號:0110258),重組大鼠白細胞介素3(IL-3,PROSPEC,批號:1108RIL301),重組人促紅細胞生成素(EPO,賽博爾,批號:201206042),兔單克隆抗體JAK2(Cell Signaling Technology,批號:D2E12),兔多克隆抗體STAT5(abcam,批號:ab68465),β-acting單克隆抗體(Cell Signaling Technology,批號:4970),山羊抗兔IgG HPR(康為世紀,批號:CW0103),甲叉丙烯酰胺(Ameresco,批號:2967B040),甲叉雙丙烯酰胺(Ameresco,批號:1209B293),cDNA第一鏈合成試劑盒(promega,A3500,批號:0000073779),Go Taq○RGreen Mix(promega,批號:0000040423),JAK2、STAT5、GAPDH、β-actin引物合成于生工生物有限公司。

    1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),超凈工作臺(北京市昌平長城空氣凈化設備公司),恒溫CO2培養(yǎng)箱(編號:B5060EK/CO2,德國產),0.22 μm濾器(PALL,批號:1419267),24孔細胞培養(yǎng)板(COSTAR,批號:3524),電泳槽,ICMIAS系列多功能圖像分析系統(tǒng),電源(Bio-Rad,041BR111842)。

    2 方法

    2.1 含藥血清的制備及處理 使用整體動物實驗結束時分離的各組大鼠血清[5]。股動脈取血,靜置2 h后,2 500 r/min低溫離心20 min,抽取上層血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用前將其置? ℃24 h融化,室溫復溫1 h后,于56 ℃水浴鍋中滅活補體30 min,0.22 μm的濾器過濾后分裝備用,-20 ℃保存。

    2.2 大鼠骨髓單個核細胞離培養(yǎng)與分組 取正常SD大鼠后股骨段骨髓,用PBS溶液反復沖洗3次,將得到的細胞懸液緩慢的加入到等量淋巴細胞分離液上層,2 500 r/min離心25 min;輕輕抽取中間白膜層骨髓單個核細胞(BMMNC),加入10%FBS IMDM洗滌2次,然后用10%FBS IMDM重懸,計數后,調整BMMNC濃度為1×106/mL。于含有1%甲基纖維素、IMDM,10%FBS、1%BSA、1×10-4M β-巰基乙醇、SCF 50ng/mL、IL-3 10ng/mL、EPO 3U/mL、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng),分別加入各個組別的含藥血清,占培養(yǎng)體系比例為20%,BMMNC密度為1×105/mL,每孔1 mL,24孔板,每組設6個復孔,周圍孔加入0.5 mL無菌超純水,將細胞板置于5%CO2、37 ℃、保持濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)。

    根據加入含藥血清的不同,分為空白對照組(30%FBS組,不含大鼠血清)、正常對照組、模型組、西藥對照司坦唑醇組(康力龍組)、益髓生血組、溫腎生血組、滋腎生血組。觀察細胞生長狀態(tài),于第4天提取細胞總RNA及蛋白。

    2.3 檢測指標及檢測方法 分別采用RT-PCR和Western blot方法檢測各組紅系細胞中JAK2、STAT5mRNA及蛋白表達,JAK2、STAT5、GAPDH、β-actin引物見表1。

    表1 基因引物序列及其擴增產物

    表2 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細胞JAK2、STAT5mRNA表達的影響

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與康力龍組相比,△P<0.05,△△P<0.01;與益髓生血組相比,□P<0.05,□□P<0.01;與溫腎生血組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    3 結果

    3.1 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細胞紅系分化JAK2、STAT5mRNA表達的影響 與正常對照組相比,模型組JAK2、STAT5mRNA表達明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),與模型組相比,各治療組JAK2、STAT5mRNA表達明顯升高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),滋腎生血組JAK2、STAT5mRNA表達高于益髓生血組和溫腎生血組,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。具體見表2,圖1-圖2。

    圖1 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細胞JAK2、STAT5mRNA的影響

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與康力龍組相比,△P<0.05,△△P<0.01;與益髓生血組相比,□P<0.05,□□P<0.01;與溫腎生血組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    圖2 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細胞JAK2、STAT5mRNA表達的影響

    注:1空白對照組;2正常對照組;3模型組;4康立龍組;5益髓生血組;6溫腎生血組;7滋腎生血組。

    表3 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對JAK2、STAT5蛋白表達的影響

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與康力龍組相比,△P<0.05,△△P<0.01;與益髓生血組相比,□P<0.05,□□P<0.01;與溫腎生血組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    3.2 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對大鼠造血干細胞紅系分化JAK2、STAT5蛋白表達的影響 模型組JAK2、STAT5蛋白表達較正常對照組明顯降低(P<0.01),與模型組相比,各治療組JAK2、STAT5蛋白表達明顯升高(P<0.01或P<0.05),滋腎生血組JAK2、STAT5蛋白表達明顯高于益髓生血組(P<0.01)、滋腎生血組JAK2蛋白表達明顯高于溫腎生血組(P<0.05)。具體見表3,圖3-圖4。

    圖3 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對JAK2、STAT5蛋白表達的影響

    注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01;與康力龍組相比,△P<0.05,△△P<0.01;與益髓生血組相比,□P<0.05,□□P<0.01;與溫腎生血組相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    圖4 補腎益髓生血法AA大鼠含藥血清對紅系細胞JAK2、STAT5蛋白表達的影響

    注:1空白對照組;2正常對照組;3模型組;4康立龍組;5益髓生血組;6溫腎生血組;7滋腎生血組。

    4 討論

    AA是常見的血液系統(tǒng)疾病之一,以外周血全血細胞減少為主要特征。中醫(yī)學認為,血液的化生與腎藏精密切相關,而AA主要表現出貧血等癥狀,故腎虛,腎不藏精,生髓不足是AA發(fā)病的關鍵病機。血液的化生離不開五臟協調,但與腎最為密切?!稄埵厢t(yī)通》云:“氣不耗,歸精于腎化為精,精不泄,歸精于肝而化清血”,《靈樞·決氣》云:“中焦受氣取汁,變化而赤是謂血”,指出腎與肝、脾胃同化;《醫(yī)精經義》曰:“腎藏精,精生髓,髓生骨……精足則髓足”,《血證論》云:“氣乃先天腎中一點腎陽,靜而復動,化生精血”,指出了腎、精、骨、髓、血的關系,反映了精髓化生血液主要取決于腎的功能。目前大多醫(yī)家認為治療AA基本上都是在“以腎為本、從腎論治”的基礎上進行變通,充分發(fā)揮中醫(yī)辨證論治AA的優(yōu)勢。

    AA患者全血細胞的減少主要源于T細胞介導的免疫異常導致造血干細胞向各系細胞分化過程中出現異常,從而導致各系成熟血細胞減少[9-10]。而紅系發(fā)育異常,導致成熟紅細胞減少,血紅蛋白濃度降低是AA患者出現貧血癥狀的主要機制,調控紅系分化成熟的信號通路主要有JAK/STAT通路、Ras/MAPK通路和PI3K通路,其中,JAK2/STAT5信號通路與EPOR信息傳遞關系最為密切[11-12]?;罨腟TAT5在EPO介導的紅系細胞分化成熟過程中是必要的,抑制STAT5活化后,紅細胞的成熟受抑制[2],STAT5可通過JAK2/STAT5信號通路來調節(jié)紅系關鍵轉錄因子GATA-1的表達,進而增強激活紅系特異基因的轉錄,促進紅系細胞分化、成熟。在紅系分化過程中,EPOR基因的表達依賴于GATA-l活性。GATA-1-miRNA軸在紅細胞生成中發(fā)揮重要作用,GATA-1可通過miRNA途徑來調控紅細胞分化成熟,已報道m(xù)iR-27a/24、microRNA-23a、miR-199b-5p能夠促進紅系生成[13-15]。研究表明,造血干細胞向紅系分化過程中,紅系分化相關基因GATA-1、Klf1、EPOR表達明顯升高,而且多向分化祖細胞MPP顯示出JAK2異常信號,提示JAK2信號能夠影響造血干/祖細胞定向紅系分化[16]。

    補腎益髓生血法組方以“腎藏精”為理論指導,包括益髓生血方(益髓生血顆粒)、溫腎生血方、滋腎生血方三方。其代表方益髓生血顆粒以山茱萸、何首烏滋陰補腎共為君藥,以熟地黃、補骨脂助君生精化血、炙黃芪、黨參健脾益氣、阿膠、當歸養(yǎng)血補血共為臣藥,雞血藤、鱉甲活血化瘀為佐藥,砂仁為使藥,以防滋膩,全方補腎為主,兼以健脾養(yǎng)肝,共奏滋腎養(yǎng)陰、益髓生血、健脾益氣之功。溫腎生血方在益髓生血顆粒的基礎上加入淫羊藿,以增強溫腎陽之功。滋腎生血方在益髓生血顆粒的基礎上入女貞子,以加強滋腎陰、壯髓生血功效。

    課題組通過前期實驗研究證明了補腎益髓生血法對AA大鼠具有肯定的療效。補腎益髓生血法可以改善AA大鼠的一般狀態(tài),增加AA大鼠體重,使外周血全血細胞增加,使血細胞形態(tài)趨于正常,增加骨髓有核細胞數,減少脂肪滴,調節(jié)外周血T淋巴細胞亞群的異常,促進造血祖細胞的增殖分化,增加造血祖細胞CFU-E、BFU-E和CFU-GM的數量,提升造血干細胞定向分化的關鍵轉錄因子GATA-1、PU.1的表達,從而促進血細胞的成熟,起到恢復AA骨髓造血的作用,并且對比研究益髓生血法、溫腎生血法和滋腎生血法,結果顯示滋腎生血法對AA大鼠貧血狀態(tài)、造血功能、免疫調節(jié)、造血祖細胞增殖分化等各個方面的改善作用優(yōu)于益髓生血法和溫腎生血法[4-5]。本研究從紅系分化關鍵的JAK2/STAT5信號通路角度入手,探討補腎益髓生血法調控AA造血干細胞定向紅系分化成熟的作用機制。

    研究結果表明,在EPO誘導造血干細胞向紅系分化過程中,加入AA大鼠血清及各治療組含藥血清干預后,模型組紅系細胞JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達顯著低于正常對照組,各治療組紅系細胞JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達顯著高于模型組,且滋腎生血組JAK2、STAT5 mRNA及蛋白表達明顯高于益髓生血組、溫腎生血組。說明補腎益髓生血法能夠影響JAK2/STAT5信號通路,增強JAK2、STAT5的表達,進而調控下游相關靶基因,促進紅系細胞的分化成熟,提示補腎益髓生血法可能通過影響JAK2/STAT5信號通路來促進紅系細胞分化成熟,從而達到治療AA的作用。對比三法,滋腎生血法對JAK2/STAT5調控作用最強,可能是由于腎精虧虛、血化無源是AA全血細胞減少的根本原因,滋腎生血方加入滋補肝腎之陰的女貞子,在益髓生血方基礎上增強了滋陰、壯髓、生血的功效,與AA病機更加切合,從而表現出較好的促進紅系造血作用。本研究闡明了補腎益髓生血法促進造血干細胞紅系分化成熟的分子機制及三法的作用特點,為深入闡明補腎益髓生血法治療AA療效機制提供了實驗依據,為中醫(yī)“腎藏精、生髓化血”理論研究及臨床應用提供了有力的實驗依據。

    [1]趙宗江,張新雪.慢性再生障礙性貧血的中醫(yī)藥研究[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學報),2011,26(11):2635-2638.

    [2]Florian G,Marc A,Kerenyi,et,al.Stat5 activation enables erythropoiesis in the absence of EpoR and Jak2[J].Hematopoiesis and Stem Cell,2008,111:4511-4522.

    [3]Fang SP,Wu ZK,Zhang XH,et al.Clinical observation on YiSuiShengXueGranule on treating 156 patients with Thalassemia major and the molecular mechanism study[J].Biol Phram Bull,2007,30(11):2084-2087.

    [4]田晨,張新雪,張豐豐,等.補腎益髓生血法再障大鼠含藥血清對大鼠造血祖細胞增殖分化及其機制的影響[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現代化,2014,16(5):1106-1113.

    [5]張新雪,張豐豐,趙宗江,等.補腎益髓生血法對60Co-γ聯合CXT誘導AA大鼠骨髓造血及免疫功能影響的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,37(6):464-470.

    [6]任丹陽,徐濤,黃成,等.5,7,3'-三乙酰橙皮素對AA大鼠成纖維樣滑膜細胞Jak2/Stat3信號通路及凋亡相關蛋白的影響[J].中國藥理學通報,2012,28(8):1063-1068.

    [7]Anne PT,Uriel B,Christian T,et al.Characterization of a Rat Uterine Cell Line,UIII Cells:Prolactin (PRL) Expression and Endogenous Regulation of PRL-Dependent Genes;Estrogen Receptorβ,α2-Macroglobulin,and Decidual PRL Involving the Jak2 and Stat5 Pathway[J].Endocrinology,2001,142(3):1242-1250.

    [8]烏格敦其其格,趙宗江,蔣玉鳳,等.糖腎平膠囊對STZ誘導糖尿病腎病大鼠腎臟保護及其對TGF-β1/p38MAPK信號轉導通路的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,26(4):1092-1097.

    [9]Young NS,Scheinberg P,Calado RT.Aplastic anemia[J].Curropin Hematol,2008,15(3):162-168.

    [10]Young NS,Bacigaupo A,Marsh JC.Aplastic anemia:pathophysiology and treatment[J].Biol Bolld Marrow Tranaplant,2010,16:110-125.

    [11]Broxmeyer HE,J Hoggatt,HA O’Leary,et al.Dipeptidylpeptidase 4 negatively regulates colony-stimulating factor activity and stress hematopoiesis[J].Nat Med,2012,18:1786-1796.

    [12]Banan M,Esmaeilzadeh GE,Nezami M,et al.cAMP response element-binding protein 1 is required for hydroxyurea-mediated induction of γ-globin expression in K562 cells[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2012,39(6):510-517.

    [13]Fang Wang,Yong Zhu,Lihua Guo,et,al.A regulatory circuit comprising GATA1/2 switch and microRNA-27a/24 promotes erythropoiesis[J].Nucleic Acids Research,2014,42(1):442-457.

    [14]Zhu Y,Wang D,Wang F,et al.A comprehensive analysis of GATA-1-regulated miRNAs reveals miR-23a to be a positive modulator of erythropoiesis[J].Nucleic Acids Res,2013,41:4129-4143.

    [15]Yuxia Li,Hua Bai,Zhongzu Zhang,et al.The Up-Regulation of miR-199b-5p in Erythroid Differentiation Is Associated with GATA-1 and NF-E2[J].Mol Cells,2014,37(3):213-219.

    [16]Ryuji I,Robert SW,Wanke Z.Stem and Progenitor cell Subsets are affected by JAK2 signaling and can be monitored by flow cytometry[J].Plos one,2014,9(4):e93643.

    (2014-04-28收稿 責任編輯:洪志強)

    Effect of Tonifying Kidney,Benefiting Marrow and Engendering Blood Method Medicated Serum of Rats with Aplastic Anemia on JAK2/STAT5 Signaling Pathway in The Erythroid Differentiation of Hematopoietic Stem Cells

    Tian Chen1,Zhao Zongjiang1,Zhang Xinxue1,Zhang Fengfeng1,Cheng Minxiu1,Zhao Jing1,Wang Yingchao1,Wu Zhikui2

    (1 Cellular and Biochemical Laboratory of Basic Medical College,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2 Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

    Objective:To investigate the effect of tonifying kidney,benefiting marrow and engendering blood method on JAK2/STAT5 signaling pathway in the erythroid differentiation of hematopoietic stem cells. Methods: On the basis of the previous in vivo animal experiment,the hematopoietic stem cells were cultivated with AA rats serum and induced erythroid differentiation in vitro. The cells were divided into the following seven groups: blank control group,normal control group,model group,stanozolol group,benefiting marrow and engendering blood group,warming kidney and engendering blood group,nourishing kidney and engendering blood group. Erythroid cells RNA and protein were extracted in 4 days respectively,and the level of JAK2,STAT5 mRNA and protein in erythroid cells were detected with RT-PCR and Western blot. Results: Compared with the normal control group,the expressing of JAK2,STAT5 mRNA and protein in cells decreased significantly in the model group(P<0.01).Compared with the model group,the expression of JAK2,STAT5 mRNA and protein both significantly increased in treatment groups(P<0.01 orP<0.05),while the nourishing kidney group was significantly better than the benefiting marrow group and warming kidney group of the expression of JAK2,STAT5mRNA and protein. Conclusion: The method of tonifying kidney,benefiting marrow and engendering blood can increase the expression of JAK2,STAT5 and promote erythroid differentiation and maturation by affecting JAK2/STAT5 signaling pathway and stimulating activity. The nourishing kidney and engendering blood method is better than benefiting marrow and warming kidney method.

    Tonifying kidney,benefiting marrow and engendering blood mthod; Aplastic anemia; Hematopoietic stem cells; Erythroid differentiation; JAK2/STAT5 signaling pathway

    國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)——基于“腎藏精”的臟象理論基礎研究——從障礙性貧血探討“腎生髓”理論的研究(課題編號:2010CB530406)

    田晨,女,研究生,研究方向:中醫(yī)藥防治再生障礙性貧血,E-mail:tianchen0901@163.com

    趙宗江,男,教授,博士生導師,主任醫(yī)師,郵編:100029,電話:(010)64286988,E-mail:zongjiangz@sina.com

    R556.5;R242;R392.7

    A

    10.3969/j.issn.1673-7202.2014.06.008

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