甘草飲片、藥對以及四君子湯中藥效組分的測定

李景松 張貴君

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京，100102)

內蒙古甘草為傳統(tǒng)道地的中藥。中藥甘草(Radix Glycyrrhizae)是豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖。甘草具有補脾益氣、止咳祛痰、清熱解毒、緩急定痛、調和諸藥的功能。

目前內蒙古炙甘草補脾益氣的臨床應用，本研究在中藥藥效組分理論的指導下[1]，依據其功能與主治，選用臨床上常用的四君子湯中，炙甘草的單味藥，2個藥對，四君子湯中的含量測定，探討內蒙古炙甘草的質量特征和評價方法。何三民[2]依據《中華人民共和國藥典》使用HPLC法測定2010年版一部收載有甘草Lycyrrhiza uralensis Fisc.的甘草苷和甘草素、異甘草素的含量分別為3.64%、0.14%、0.125%。欒海云等[3]建立甘草中甘草苷含量測定的HPLC法，測定不同產地甘草中甘草苷的含量，以控制其質量。劉磊等[4]采用HPLC法測定了同一產地、批次的生甘草和炙甘草中甘草苷和甘草酸的含量，發(fā)現蜜炙甘草后的甘草苷和甘草酸的含量增加，驗證蜜炙因素可顯著增加甘草中二者的含量。張玲等[5]用HPLC法測定甘草酸和甘草苷含量在四君子湯復方中分別為1.41%和1.44%。劉紅文[6]使用薄層色譜法定性鑒別六味地黃丸中的甘草苷，使用液相色譜法測量甘草苷的含量，為該味成藥的生產提供相應的質量控制標準。以控制其主要活性成分為甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素等甘草黃酮類具有抑菌、以及保肝作用等活性[7－10]，和甘草皂苷類成分質量。四君子湯作為治療脾胃氣虛證，在中醫(yī)內科脾胃氣虛證的治療中得到了廣泛的運用[11]。甘草苷和異甘草苷具有抗?jié)?、抗菌、抗炎[12]，而其衍生物既能促進胰島素的吸收，還具有抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗缺氧等作用[13]。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器，Agilent 1100高效液相色譜儀(HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動進樣，HP柱溫箱，HPDAD檢測器);Agela Venusil HPLC Clumns(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱;BP110S電子分析天平;BT25S型電子分析天平。

標準品，甘草苷(批號:111208)，異甘草苷(批號120112)，甘草素(批號 120302)，甘草酸(批號111201)。甲醇為色譜純(購自fisher公司)，水為娃哈哈純凈水。

內蒙古野生炙甘草飲片，均購于河北安國祁新飲片公司，經北京中醫(yī)藥大學張貴君教授鑒定。

藥對又稱“對藥”“對子藥”“姊妹藥”是指臨床常用的、相對固定的兩味藥物的配伍形式，是中藥配伍中的最小單位[14]?！渡褶r本草經·序例》指出:“藥有單行者，有相須者，有相使者，有相畏者，有相惡者，有相反者，有相殺者，凡此七情，合和視之。藥對炙甘草－人參，配伍比例:炙甘草－人參3∶5;出處:四君子湯，《太平惠民和劑局方》。藥對炙甘草－白術，配伍比例:炙甘草－白術1∶1;出處:四君子湯，《太平惠民和劑局方》。復方四君子湯，組成:人參去蘆(10 g)，白術茯苓去皮、甘草炙(6 g)各等分;出處:四君子湯《太平惠民和劑局方》。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agela Venusil HPLC Clumns(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.05%磷酸－ 水(0—8 min，19∶81;8—11 min，23∶77;11—21 min，24—76;21—44 min，50∶50;44—45 min，100∶0;45—50 min，19—81);流速:1.0 mL·min－1;進樣量:10 μL;柱溫:室溫(30℃);檢測波長:237 nm、360 nm。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量對照品甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸[15]，分別置于 10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別得到濃度為 86 μg·mL－1、10 μg·mL－1、20 μg·mL－1、250 μg·mL－1的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 按照各配伍比例稱取甘草及其他中藥，加10倍量水浸泡30 min后煎煮兩次，第一次30 min，第二次20 min，合并煎液，趁熱過濾，濾液濃縮至每1 mL相當于原藥材0.1 g的濃縮液，取濃縮液1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，相對中藥濃度為 0.01 g·mL－1，即為供試液。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2 結果

2.1 線性關系考察 甘草苷標準品溶液分別進樣0.3、3、6、9、12、18 μL，異甘草苷標準品溶液分別進樣1、4、8、12、16、20 μL，甘草素標準品溶液分別進樣1、3、6、9、12、18 μL，甘草酸標準品溶液分別進樣 0.5、4、8、12、16、20 μL。以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得甘草苷回歸方程Y=146.5X+20.51，R2=0.9993，表明甘草苷在25.800～154.800ng線性關系良好。異甘草苷的回歸方程Y=28.25X–1.177，R2=0.9996，表明異甘草苷在10.000～200.000 ng線性關系良好。甘草素的回歸方程Y=45.61X–0.022，R2=0.9996，表明甘草素在 20.000 ～360.000 ng線性關系良好。甘草酸的回歸方程Y=75.32X–0.398，R2=0.9998，表明甘草酸 125.000 ～5000.000 ng在線性關系良好。

2.2 精密度試驗 分別精密吸取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸標準品溶液，連續(xù)進樣6次，安各成分的色譜條件測定峰面積。RSD分別為1.04%、1.51%、1.69%、1.19%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗 稱取內蒙古野生炙甘草供試品6 g，按供試品按供試品的溶液的制備項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在 0，2，4，6，8，10，12 h 按2.1.1項下進行峰面積測定，甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸RSD依次分別為1.93%，1.69%，1.46%，2.73%，表明供試品溶液在12h內穩(wěn)定。

2.4 重復性試液 精密吸取同一批供試品溶液，進樣10 μL，依照標準曲線測定方法連續(xù)測定6次，根據峰面積計算RSD值，得到4種組分重現性RSD值分別為1.84%，1.77%，1.64%，2.24%，表明本方法重現性良好。

2.5 加樣回收率試驗 精密稱取取內蒙古野生炙甘草飲片6份，按供試品溶液制備項下方法制備，分別精密加入4種基本等量標準品溶液，注入液相色譜儀進行含量測定，見表1。

2.6 藥效組分測定 分別制備3批供試品，每個供試品連續(xù)進樣3次，進樣量10 μL，高效液相色譜測定峰面積，根據外標法計算各組分的含量，見圖1－圖8，表2。

表1 內蒙古野生炙甘草藥效組分加樣回收率測定

2.6.1 標準品圖譜 見圖1－圖4。

圖1 甘草苷標品HPLC圖譜

圖2 異甘草苷標品HPLC圖譜

圖3 甘草素標品HPLC圖譜

圖4 甘草酸標品HPLC圖譜

2.6.2 單味藥圖譜 見圖5。

圖5 內蒙古野生炙甘草HPLC圖譜

2.6.3 藥對圖譜 見圖6－圖7。

圖6 炙甘草－人參藥對HPLC圖譜

圖7 炙甘草－白術藥對HPLC圖譜

2.6.4 復方圖譜 見圖8。

圖8 四君子湯HPLC圖譜

2.7 四種藥效組分在單味藥、藥對、復方中的含量見表2。

表2 藥效組分含量(mg/mL)

3 討論

課題實驗結果顯示，經過藥對與復方配伍以后，四種藥效組分含量均有下降，且下降幅度較大。其中，單味藥與復方相比下降尤為明顯(甘草苷下降75%，甘草素下降75%，甘草酸下降74%，異甘草苷下降77%)?？梢钥闯?，由于配伍的變化影響著甘草藥效組分的溶出效率，而由于復方才是作為發(fā)揮作用療效的關鍵，并非一種或某幾種成分，而是多種成分的相互作用，所以，單純地把某一單體或幾個單體含量作為質量檢測標準有欠妥當，而應該把療效與質量標準聯系起來，將藥效組分作為質量控制的多指標。

就藥對間實驗結果來看，藥對(炙甘草－白術)四種藥效組分含量均高于藥對(炙甘草－人參)，藥對(炙甘草－白術)與復方進行比較(甘草苷下降60%，甘草素下降62%，甘草酸下降55%，異甘草苷下降58%)，而藥對(炙甘草－人參)與復方四君子湯中各項含量差別較小。由于許多方劑組成復雜而為質量控制帶來不便，可從方劑中選擇合適的藥對或者其中幾味藥的藥效組分進行質量控制指標，藥對代替復方的前提是務必選擇合適的，如本課題中藥對(炙甘草－人參)，倘若選擇欠佳，如課題中藥對(炙甘草－白術)代替四君子湯則不利于質量控制。但在復方組成并不太復雜的情況下，為了質量控制的嚴謹性，應盡量選擇整個復方作為控制載體。

本課題以內蒙古野生甘草單味藥、藥對以及復方作為研究載體，以探索甘草中藥效組分變化規(guī)律，實驗結果為藥效組分甘草苷－甘草素－甘草酸－異甘草苷在單味藥(內蒙古野生炙甘草)中含量為(12.14±0.31)，(3.25 ±0.19)，(38.75 ±1.77)，(1.4 ±0.25);在藥對(炙甘草－人參)中含量為(2.87±0.04)，(0.74±0.02)，(6.42±0.18)，(0.37±0.03);在藥對(炙甘草－白術)中含量為(5.99±0.01)，(2.16±0.09)，(22.4±1.8)，(0.77±0.02):在復方(四君子湯)中含量為(2.99±0.03)，(0.81±0.04)，(10.05±0.31)，(0.32±0.03)。其可以為甘草中藥材完善嚴謹的質量標準提供一定的科學依據。

[1]張貴君，羅容，王奕潔.中藥藥效組分理論與中藥組分學[J].中藥材，2007，30(2):125.

[2]何三民.HPLC法測定甘草中甘草素、異甘草素、甘草苷的含量[J].中草藥，2003，34(7):618－619.

[3]欒海云.HPLC法測定不同產地甘草中甘草苷的含量[J].安徽農業(yè)科學刊，2011，39(25):12121－12122.

[4]劉磊.炮制因素對甘草中有效成分甘草苷和甘草酸的影響[J]，徐州醫(yī)學院學報2009，29(10):637－640.

[5]張玲.四君子湯和理中丸中甘草酸及甘草苷含量測定[J]，實驗方劑學，2007，13(6):4－6.

[6]劉洪文.六味甘草丸中甘草苷的鑒別和含量測定[J]，陜西中醫(yī)，2010，31(3):353－354.

[7]靳茂禮，趙艷普，王潤彪，等.高效液相色譜法測定胃痛舒片中甘草苷含量[J].中國藥業(yè)，2012，21(24):66－67.

[8]楊玲娟.HPLC法測定芍藥甘草湯總有效部位中4個活性成分的含量[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，3(25):521－523.

[9]TAMIRSS，EIZENBERGM，SOMJEND，et al.Estrogen－ like activity of glabren and other constituents isolated from licorice root[J]，J Steroid Biochem，2001，78(3):291－298.

[10]FUHRMAN B，VOLKOVAN，KAPLAN M，et al.Antiatherosclerotic effects of licorice extract supplementation on hypercholesterolemic patients:increased resistance of LDL to atherogenic m，Mifications，reduced plasma lipid levels，and decreased systolic blood pressure[J].Nutrition，2002，18(3):268－273.

[11]高永珍，武瑞珍，陳永利.四君子湯在中醫(yī)內科疾病脾胃氣虛證中的運用[J].中國民族民間醫(yī)藥，2013，22(3):52.

[12]張明發(fā)，沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎與抗炎機制的研究進展[J].現代藥物與臨床，2011，26(4):261－2680.

[13]Li Songpei，Li Wei，Yinghua W，et al.Prenylflavonoids from Glycyrrhiza uralensis and their protein tyrosine phosphatase－1B inhibitory activities[J].Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2010，20(18):5398－5401.

[14]劉萍，王平，劉松林，等.基于藥對探討中藥復方配伍規(guī)律的思考[J].中華中醫(yī)藥學刊，2010，28(9):1833－1835.

[15]李偉，王躍飛，文紅梅，等.HPLC－DAD同時分析甘草中7種有效成分[J].中國藥學雜志，2008，43(24):1914－1918.