胰蛋白酶原激活肽和C-反應(yīng)蛋白對大鼠急性胰腺炎的診斷價值

欒 濤，張紅軍，萬建平，王雅麗，胡永勝，王 曦，夏越超

胰蛋白酶原激活肽和C-反應(yīng)蛋白對大鼠急性胰腺炎的診斷價值

欒 濤1，張紅軍1，萬建平2，王雅麗1，胡永勝1，王 曦1，夏越超1

目的探討血清胰蛋白酶原激活肽(trypsinogen activation peptide, TAP)和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)在大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法將96只SPF級健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和AP組，每組48只。假手術(shù)組僅打開腹腔翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹，AP組建立急性胰腺炎動物模型，兩組在造模后3、6、12、24 h四個時點分批處死。每只大鼠處死前腹主動脈采血5 ml，取胰腺組織進(jìn)行HE染色并做病理評分。應(yīng)用ELISA法定量檢測各組大鼠血清TAP和CRP的含量。結(jié)果(1)AP組胰腺組織病理評分隨造模時間延長明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)假手術(shù)組與AP組造模后同時點比較，TAP水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組各時點間比較，TAP水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，AP組造模后3 h(1.41±0.19)、6 h(2.09±0.33)、12 h(3.16±0.23)、24 h(4.53±0.28)四個時點比較，TAP水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。(3)AP組造模后各時點間比較，CRP水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。(4)血清TAP(r=0.942)、CRP(r=0.926)含量均與胰腺組織病理評分呈高度正相關(guān)(r>0.7，P<0.05)。結(jié)論血清TAP可作為早期診斷急性胰腺炎的可靠指標(biāo)；對TAP和CRP動態(tài)檢測可判斷AP的嚴(yán)重程度。

急性胰腺炎；胰蛋白酶原激活肽；C-反應(yīng)蛋白；大鼠

急性胰腺炎可分為輕癥(mild acute pancreatitis，MAP)和重癥(severe acute pancreatitis，SAP)兩型，其中SAP并發(fā)癥多，可表現(xiàn)為胰腺局部的炎性反應(yīng)，全身炎性反應(yīng)和胰外器官損傷[1]。造成AP 早期病理損害的主要機(jī)制是胰酶活化，炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子和氧自由基大量產(chǎn)生而引發(fā)機(jī)體超強的炎性反應(yīng)[2]。在胰蛋白酶原被活化成胰蛋白酶的過程中，可以釋放出特異性的產(chǎn)物——TAP，定量檢測血清TAP變化可直接反映胰蛋白酶原的激活，是胰蛋白酶原激活的分子標(biāo)志物，并具有高度的特異性，可作為臨床上早期診斷和評估AP患者病情輕重的一個良好指標(biāo)。CRP是一種機(jī)體急性期反應(yīng)蛋白，是非常敏感的炎性反應(yīng)和組織損傷標(biāo)志物。大量的研究證明，CRP在急性胰腺炎過程中的重要性，其水平高低與胰腺炎的嚴(yán)重程度及并發(fā)癥相關(guān)[3，4]。本研究旨在通過對大鼠AP血清中CRP、TAP濃度動態(tài)測定，探討血清TAP和CRP在急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中的作用，為AP早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠，3～4月齡，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物許可證號：SCXK2004-0006，編號0000886。25 ℃條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 設(shè)備與試劑 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；高速低溫離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；組織包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國LEICA公司)；顯微成像系統(tǒng)(尼康映像儀器銷售有限公司)；酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)；Excelsior ES自動組織脫水機(jī)(Thermo Scientific公司)；TAP ELISA試劑盒(上海史瑞克生物科技有限公司)；CRP ELISA試劑盒(上海信然生物技術(shù)有限公司)；?；悄懰徕c(美國Sigma公司)。

1.3 動物分組及模型制備 健康雄性Wistar大鼠96只，隨機(jī)分成2個大組：假手術(shù)組和AP組，每組48只。各組實驗大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。用22%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，乙醇消毒手術(shù)域。進(jìn)入腹腔，找到胰腺后，分別在胰頭、胰體及胰尾部多點緩慢注射5%牛黃膽酸鈉(natrii tauroglycocholas, Na-Tc)，總量按1 ml/kg計算。假手術(shù)組打開腹腔后，僅對胰腺翻動數(shù)次后關(guān)腹。造模后分組擱置，大鼠清醒后自由飲水。

1.4 標(biāo)本采集 假手術(shù)組和AP組分別在造模后3、6、12、24 h四個時點分批處死，每個時點處死12只大鼠。解剖大鼠，觀察胰腺大體病理變化；由腹主動脈采血5 ml，注入密封促凝采血管中靜置1 h后，以3000 r/min低溫離心10 min，分離血清用于TAP及CRP測定。取部分胰腺組織浸泡在10%甲醛液后備用。

1.5 測定項目及方法 對各組大鼠胰腺組織行病理切片HE染色，并進(jìn)行胰腺組織病理評分(histopathologic scoring, HS)以評估胰腺組織病變損傷程度。應(yīng)用ELISA法定量檢測各組大鼠血清TAP及CRP含量。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺組織病理改變 假手術(shù)組各時點胰腺腺泡結(jié)構(gòu)正常，排列緊密。AP組隨造模時間延長，胰腺腺泡結(jié)構(gòu)逐漸消失，胰腺小葉間隙、腺泡間隙、細(xì)胞間隙逐漸增寬，血管周圍有炎性細(xì)胞滲出；AP組造模后24 h，可見胰腺組織呈大片狀壞死，有的整個小葉壞死，壞死區(qū)域腺泡結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞玻璃樣變、核溶解消失，胰周脂肪壞死(圖1)。

圖1 假手術(shù)組和AP組各時點大鼠胰腺病理變化(HE，×400)

2.2 胰腺組織病理評分、CRP、TAP含量檢測 (1)AP組胰腺組織病理評分隨造模時間延長明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)假手術(shù)組與AP組造模后同時點比較，TAP水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組各時點間比較，TAP水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，AP組造模后各時點間比較，TAP水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；(3)假手術(shù)組造模后6 h與12、24 h比較，CRP濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AP組造模后CRP水平隨時間延長而升高，各時點間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 假手術(shù)組與AP組各時點HE病理評分、TAP濃度、CRP濃度比較 ±s)

注： 與AP組造模后3 h比較，①P<0.05；與AP組造模后6 h比較，②P<0.05；與AP組造模后12 h比較，③P<0.05；與假手術(shù)組造模后3 h比較，④P<0.05；與假手術(shù)組造模后6 h比較，⑤P<0.05

2.3 TAP、CRP水平與胰腺病理評分的相關(guān)性 血清TAP(r=0.942)、CRP(r=0.926)含量均與胰腺組織病理評分呈高度正相關(guān)(r>0.7，P<0.05)。見圖2、3。

圖2 血清CRP濃度與胰腺病理評分的相關(guān)關(guān)系

3 討 論

3.1 TAP在AP發(fā)病機(jī)制中的作用 AP的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響[5，6]。目前比較公認(rèn)的AP發(fā)病機(jī)制包括[7]：(1)胰腺自身消化學(xué)說；(2)白細(xì)胞過度激活—炎性因子學(xué)說；(3)氧化應(yīng)激學(xué)說；(4)腸道細(xì)菌移位學(xué)說；(5)胰腺腺泡內(nèi)鈣超載學(xué)說；(6)胰腺微循環(huán)障礙學(xué)說。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AP發(fā)病機(jī)制與始發(fā)的胰腺細(xì)胞內(nèi)事件、早期炎性反應(yīng)和晚期炎性反應(yīng)等密切相關(guān)[8]。在生理狀況下，胰腺能分泌十余種酶[9]，其中以胰淀粉酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、彈性蛋白酶等為主。當(dāng)胰腺在各種致病因素的作用下，便釋放出溶酶體水解酶，則酶原顆粒和水解酶通過一種吞噬現(xiàn)象而融合，致使酶原在細(xì)胞內(nèi)活化；或者胰蛋白酶原流入十二指腸，受到腸液中腸激酶的激活作用后變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。在胰蛋白酶原被活化成胰蛋白酶的過程中，可以釋放出特異性的產(chǎn)物——TAP。TAP是位于胰蛋白酶原氨基末端的激活肽，在哺乳動物中有高度同源性。一分子的胰蛋白酶原只產(chǎn)生一分子的TAP。急性胰腺炎所產(chǎn)生的TAP一般在發(fā)病數(shù)小時即可通過胰腺滲入腹腔，進(jìn)入血液循環(huán)。Mansfield和Jones[10]通過實驗與臨床研究指出，急性胰腺炎時，TAP濃度的變化早于其病理變化。定量測定TAP可直接反映胰蛋白酶原的激活程度和胰腺損傷程度，具有高度的特異性，其濃度高低與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。本研究顯示，在造模后3 h，當(dāng)假手術(shù)組與AP組在胰腺病理組織學(xué)上無顯著差異時，兩組血TAP水平已有統(tǒng)計學(xué)差異，且隨著造模時間的延長，AP組血TAP濃度與胰腺組織損傷程度呈正相關(guān)。故早期檢測并動態(tài)觀察血TAP濃度水平有助于AP的早期診斷和對AP嚴(yán)重程度的評估。

圖3 血清TAP濃度與胰腺病理評分的相關(guān)關(guān)系

3.2 CRP在AP診斷中的作用 研究發(fā)現(xiàn)，多種炎性因子參與AP的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素、CRP、血小板活化因子、磷脂酶A2等，這其中以CRP升高最為顯著[12,13]。CRP是一種非常敏感的炎性反應(yīng)和組織損傷標(biāo)志物[14]，壞死性胰腺炎時CRP水平明顯升高，可達(dá)正常值的18倍[15]。當(dāng)感染和損傷發(fā)生時, 其濃度急劇上升，3～6 h開始升高，24～48 h達(dá)到峰值[16]，其水平高低反映炎性反應(yīng)程度高低。目前許多研究認(rèn)為，CRP濃度的高低與AP的嚴(yán)重程度及并發(fā)癥相關(guān)，而CRP在AP的早期診斷中無明顯特異性[17]。本研究顯示，假手術(shù)組雖只對大鼠胰腺進(jìn)行數(shù)次翻動后關(guān)腹，3 h后也可引起血清CRP濃度升高，6 h后逐漸下降，12 h后濃度差異已無統(tǒng)計學(xué)意義。與AP組造模后3 h比較，假手術(shù)組血清CRP濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證實CRP是一種判斷組織損傷和炎性反應(yīng)的敏感標(biāo)志物。而AP組由于炎性反應(yīng)持續(xù)存在，血清CRP濃度持續(xù)升高，且隨AP組造模時間的延長，與胰腺病理損傷呈正相關(guān)。

綜上所述，本研究顯示，早期聯(lián)合動態(tài)檢測血清TAP和CRP濃度有助于早期診斷AP，并可為早期評估AP嚴(yán)重程度提供依據(jù)。

[1] 袁柏思, 朱人敏, 張曉華, 等. 急性胰腺炎肝巨噬細(xì)胞表達(dá)的FasL在肝損傷中的作用 [J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2008, 21(5): 480-482.

[2] Zhang X P, Chen L, Hu Q F,etal. Effects of large dose of dexamethasone on inflammatory mediators and pancreatic cell apoptosis of rats with severe acute pancreatitis [J]. World J Gastroenterol，2007, 13: 5506-5011.

[3] 秦仁義, 裘法祖. 炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子在急性壞死性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用 [J]. 中國普外基礎(chǔ)和臨床雜志，1998, 5: 361.

[4] 沈 霞. C-反應(yīng)蛋白臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀和展望 [J]. 中國實驗診斷學(xué)，1999, 3(5): 95.

[5] 李震東, 馬清涌, 羅羽宏. Fas /FasL介導(dǎo)的caspase-3活化與急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志，2009, 25(6): 1197-1201.

[6] 唐詩彬, 張肇達(dá), 吳路楊, 等. 急性壞死性胰腺炎大鼠白細(xì)胞L-選擇素表達(dá)和肌動蛋白分布的變化及中藥華西胰腺炎一號的影響[J]. 中國病理生理雜志，2009, 25(7): 1381-1385.

[7] 林旭紅,李永渝. 急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展 [J]. 中國病理生理雜志，2010,26(5): 1029-1032.

[8] 黃筵庭. 急性胰腺炎細(xì)胞內(nèi)早期事件的再認(rèn)識[J]. 中華肝膽外科雜志，2006, 12(2):75-76.

[9] Lerch M M, Kruger B, Tessenow W,etal. Role of protease activation in patho- physiology of actue pancreatitis [J]. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd，1998, 115:421-426.

[10] Mansfield C S, Jones B R. Plasma and urinary trypsinogen activation pep- tide in healthy dogs, dogs with pancreatitisand dogs with other systemic diseases [J]. Aust Vet J，2000, 78(6): 416-422.

[11] 高 軍, 張淑文, 李 非. 胰蛋白酶原激活肽在大鼠實驗性急性胰腺炎中的產(chǎn)生及意義 [J]. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2010, 8(5): 301-306.

[12] Bhatia M, Brady M, Shokuhi S,etal. Inflammatory mediators in acute pancreat- itis [J]. J Pathol ，2000, 190(2): 117-125.

[13] 王世文，孫志江，王映珍，等. 胰島素樣生長因子1對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的影響[J].中國急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志, 2012,7(3):247-249.

[14] 沈 霞. C-反應(yīng)蛋白臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀和展望 [J]. 中國實驗診斷學(xué)，1999, 3: 95.

[15] Leser H G, Gross V, Scheibenbogen C.Evaluation of serum interleukin-6 concern- tration precedes acute-phase response and reflects severity in acute pancreatitis [J]. Gastroenterology ，1991,101: 782.

[16] 張 燕, 吳建新. C反應(yīng)蛋白對重癥急性胰腺炎的診斷價值 [J]. 胃腸病學(xué)，2006, 11(4): 251-253.

[17] Olczyk P, Kozma E M, Olczyk K,etal. Biochemical Diagnostics in Acute Pancreatitis Recognition and outcome Predicition [J]. Przegl Lek，2004, 61 (12) : 1420-1427.

(2014-01-02收稿 2014-06-09修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

CorrelationstudybetweenbothtrypsinogenactivationpeptideandC-reactiveproteinwithacutepancreatitisinrats

LUAN Tao1，ZHANG Hongjun1， WAN Jianping2, WANG Yali1, HU Yongsheng1，WANG Xi1，and XIA Yuechao1. 1.Department of General Surgery，Liaoning Provincial Crops Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Shengyang 110034，China; 2.The outpatient department of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100089, China

ObjectiveTo study the role of serum TAP and CRP in occurrence and development of acute pancreatitis(AP) in rats. It can provide a theory basis for early diagnosis of AP.Methods96 specific pathogen free(SPF) Wistar male rats were divided into two groups randomly (n=48 in each group): sham-operated group and AP model group. In sham-operated group,we only opened the abdominal cavity and touched pancreas several times.In AP model group, 5% Na-Tc was injected under the membrane of pancreas to establish AP animal model. The rats were killed at 3 rd, 6 th, 12 th and 24 th hour after modeling in each group. A portion of pancreatic tissues was examined by hematoxylin-eosin(HE) staining. We detected the concentration of TAP and CRP in serum by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) .ResultsThe concentration of TAP in sham-operated group, compared with AP group at the same time, was significantly different (P<0.05). The concentration of TAP in AP group had significant differences (P<0.05) compared with each other. The concentration of CRP in sham-operated group at 6th, 12th, 24th hour compared with AP group at the same time was significantly different (P<0.05). The concentration of CRP in AP group had significant differences (P<0.05) compared with each other. The concentration of TAP and CRP showed higher positive correlation with the pancreatic histopathologic scores.ConclusionsSerum TAP can be used for diagnosis of AP in early stage for judgment. TAP and CRP detected dynamically in AP in early stage can be used as indicators of serverity, which plays an important role in forecasting AP.

acute pancreatitis;trypsinogen activation peptide;C-reactive protein;rat

欒 濤，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：luantao13099@126.com

1. 110034沈陽，武警遼寧總隊醫(yī)院普外科；2. 100089北京，武警總部機(jī)關(guān)門診部

R657.5