骨髓間充質(zhì)干細胞治療新生重度缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達

胡合珍，滑蓉蓉，安沂華，王曉東,

骨髓間充質(zhì)干細胞治療新生重度缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達

胡合珍1，滑蓉蓉2，安沂華2，王曉東1,2

目的初步探討骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)治療新生重度缺氧缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達及其與療效的關(guān)系。方法60只6日齡SD大鼠被隨機分為手術(shù)對照組(NS組)、空白對照組(BC組)和干細胞移植組(MSC組)，每組20只，制備重度缺氧缺血性腦損傷大鼠模型。將BM-MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、擴增后，經(jīng)枕大池移植到MSC組模型大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔中，NS組用相同體積的生理鹽水代替BM-MSCs，BC組于模型建立后不進行任何移植。經(jīng)上述處理后3、7、14、21 d對大鼠進行改良神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores，mNSS)，同時收集大鼠腦脊液檢測神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)、膠質(zhì)細胞源性神營養(yǎng)因子(glia cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。結(jié)果MSC組及NS組大鼠在移植后第7、14和21天,其mNSS評分與移植前和移植后第3天相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MSC組、NS組及BC組移植后21 d mNSS評分分別為7.0±2.8、10.0±3.7和11.0±1.6。與第3天比較，BC組僅在移植后21 d出現(xiàn)差異并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，移植后7 d和14 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腦脊液檢測發(fā)現(xiàn)MSC組神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、NT-3、BDNF及GDNF的表達較移植前有顯著增加(P<0.05)，而NS組和BC組表達反而減少(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)枕大池移植BM-MSCs對腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)具有促進作用，推斷NGF、NT-3、BDNF、GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子在其中起重要作用，其具體作用機制有待進一步研究。

骨髓間充質(zhì)干細胞；缺氧缺血性腦損傷；神經(jīng)營養(yǎng)因子；移植

骨髓間充質(zhì)干細胞具有良好的自我更新能力和多分化潛能,以及遷移性、低免疫性、良好的組織融合性等特點，成為公認的組織修復(fù)與再生的種子細胞[1]。近年來，隨著BM-MSCs研究的進展，神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)修復(fù)過程中越來越重要。本研究在新生重型缺氧缺血性腦損傷大鼠模型建立成功及體外成功培養(yǎng)出BM-MSCs之后，探討B(tài)DNF、NT-3、NGF、GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子是否協(xié)同BM-MSCs參與腦損傷大鼠的腦損傷組織修復(fù)，改善其受損神經(jīng)功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 新生雌性Sprague-Dawley大鼠60只，體重13～17 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供。將60只6日齡SD大鼠隨機分為手術(shù)對照組(NS組)、空白對照組(BC組)和干細胞移植組(MSC組)，每組20只。

1.2 實驗材料制備 人BM-MSCs的培養(yǎng)、傳代、鑒定[2]：獲得骨髓標本后，制備細胞重懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞90%融合時以1∶3比例進行傳代，流式細胞儀鑒定為BM-MSCs。

1.3 重度缺氧缺血性腦損傷大鼠模型的建立(改良Rice法) 10%水合氯醛按0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉后，仰臥位手術(shù)臺上固定四肢，手術(shù)區(qū)域消毒，頸正中線縱向切開皮膚，暴露皮下組織，以氣管和右迷走神經(jīng)為參照找到右側(cè)頸總動脈，分離出血管后雙重結(jié)扎，并從結(jié)扎線中間剪斷血管，縫合切口。手術(shù)2 h后將大鼠置入密閉缺氧箱中(缺氧箱中連續(xù)2.5 h泵入92%N2+8%O2混合氣體，氣流量1 L /min)[3]。

1.4 BM-MSCs枕大池移植 在腦立體定位儀上操作，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠頭前傾位固定，在枕外粗隆和第一頸椎最高點之間的連線中點，微量進樣器沿兩耳連線的中點方向穿刺[4]，感覺明顯的落空感后回抽見清亮腦脊液，以100 μl/min注入BM-MSCs懸液100 μl。NS組用等量的生理鹽水代替干細胞懸液。BC組則不進行任何移植。

1.5 改良神經(jīng)功能缺損評分 分別于移植后3、7、14、21 d，對3組大鼠進行mNss[5]的評估。

1.6 神經(jīng)營養(yǎng)因子檢測及表達 分別于移植后3、7、14、21 d,利用干細胞移植相同方法分別對3組大鼠進行腦脊液收集，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測腦脊液中的NGF、NT-3、BDNF、GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子，用熒光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RT- PCR) 進行NGF、NT-3、BDNF、GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達檢測。

2 結(jié) 果

2.1 BM-MSCs體外培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)特征(圖1)。

圖1 BM-MSCs光鏡觀察(×100)培養(yǎng)48 h后光鏡觀察可見細胞增殖旺盛，呈“魚群”樣

2.2 模型大鼠的建立 建模手術(shù)后大鼠表現(xiàn)為固定向術(shù)側(cè)旋轉(zhuǎn)運動及術(shù)側(cè)肢體癱瘓，表明改良Rice法建立重度缺氧缺血性腦損傷大鼠模型成功。

2.3 大鼠神經(jīng)功能評價 表1結(jié)果顯示，在腦損傷模型建立后及移植后3 d，3組大鼠mNSS評分均較高。MSC組與NS組在移植后7、14和21 d的評分較移植前和移植后3 d均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，從移植后7 d開始，兩組大鼠mNSS評分開始降低，且MSC組降分幅度大于NS組，術(shù)后21 d評分顯示，MSC組與NS組、BC組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，NS組與BC組相比則差異不明顯(P>0.05)。BC組移植后7 d和14 d與移植前和移植后3 d相比無明顯變化，移植后21 d則差異明顯(P<0.05，表1)。

表1 3組缺氧缺血腦損傷大鼠移植前后mNSS評分比較 (n=20；±s)

注：與移植前相比，①P<0.05; NS組相比，②P<0.05; BC組相比，③P<0.05

2.4 RT-PCR檢測NGF、NT-3、BDNF、GDNF的表達 模型建立后，3組大鼠腦脊液中NGF、NT-3、BDNF和GDNF在腦損傷刺激下均有所表達。MSC組各神經(jīng)營養(yǎng)因子移植后第3天開始顯著升高(P<0.05)，術(shù)后7～14 d表達減少處于“表達低谷期”，但仍高于移植前的表達(P<0.05)，第14～21天繼續(xù)增加，在術(shù)后第21天仍處于明顯高值(P<0.05)。NS組和BC組各神經(jīng)營養(yǎng)因子表達為移植3 d后有明顯增加(P<0.05)，但在7～14 d“表達低谷期”各因子表達明顯降低，均低于移植前(P<0.05)，14～21 d因子表達較“表達低谷期”增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且表達未高于移植前。MSC組較NS組、BC組，術(shù)后3 d及術(shù)后21 d因子表達均增高(P<0.05)，NS組與BC組相比則無此表達趨勢。見表2。

表2 3組大鼠移植前后NGF、NT-3、BDNF和GDNF神經(jīng)營養(yǎng)因子表達比較 (n=20；

注：與移植前相比，①P<0.05;與移植后3 d相比，②P<0.05;與移植后7 d相比，③P<0.05;與移植后14 d相比，④P<0.05;與NS組相比，⑤P<0.05;與BC組相比，⑥P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，BDNF缺乏的小鼠，其周圍感覺神經(jīng)元數(shù)量減少，前庭神經(jīng)節(jié)嚴重變性[6]；NT-3可以誘導(dǎo)神經(jīng)突起的生長和促進神經(jīng)遞質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達[7]；NGF能提高基底前腦和紋狀體膽堿能神經(jīng)元的cAMP水平，增高膽堿乙酰移位酶的活性，并對這些神經(jīng)元的生長和存活起重要作用[8]；GDNF不僅能夠促進多種神經(jīng)元的存活和分化，對多巴胺神經(jīng)元有明顯的營養(yǎng)和促存活作用,減輕腦水腫，保護腦損傷后的神經(jīng)元，還對精原細胞的再生和分化有決定作用，GDNF缺失的小鼠表現(xiàn)為干細胞數(shù)量的減少，而GDNF的過度表達導(dǎo)致未分化的精原細胞的累積[9]。

本研究成功建立新生重度缺氧缺血性腦損傷大鼠模型后，從體外培養(yǎng)出人 BM-MSCs，通過枕大池移植途徑，移植于腦損傷模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，進入腦脊液循環(huán)。在一些趨化因子的作用下向損傷部位聚集而發(fā)揮作用，從而避免腦內(nèi)原位移植帶來的二次損傷，減少損傷灶內(nèi)的炎性因子、血凝塊等不利于移植后的BM-MSCs存活、生長的因素刺激[10]。于移植后不同時間點評估神經(jīng)功能改善情況并檢測NGF、BDNF、GDNF、NT-3等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。

mNSS評分結(jié)果中MSC組及NS組評分于移植后均降低，但MSC組變化程度大，說明給予腦損傷大鼠在移植的干細胞刺激下，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)速度更快，受損功能改善更多，干細胞對于改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能具有非常明顯的作用。BC組的評分結(jié)果在移植后21 d出現(xiàn)明顯變化，說明大鼠在缺氧缺血性腦損傷后，神經(jīng)功能障礙存在一定程度的自身恢復(fù)，但是恢復(fù)所需時間較長，改善程度小。本實驗中大鼠腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的主要機制可能有以下幾個方面:(1)BM-MSCs在腦內(nèi)特化成神經(jīng)組織,替代損傷的細胞,重建神經(jīng)環(huán)路[11]；(2)移植的BM-MSCs細胞在腦內(nèi)激活內(nèi)源性修復(fù)反應(yīng)或分泌神經(jīng)因子給宿主細胞提供營養(yǎng)支持；(3)骨髓細胞中包含有血管內(nèi)皮細胞,缺血性損傷能刺激血管內(nèi)皮祖細胞從骨髓中被動員到外周血中,歸巢、匯集到缺血組織中,分化成內(nèi)皮細胞,形成新血管[12]；(4)自體腦內(nèi)的神經(jīng)干細胞在腦損傷后可能也發(fā)揮著積極的作用。本研究中，最長觀察時間為移植后21 d，由于觀察時間有限，不能很好說明干細胞移植后體內(nèi)發(fā)揮作用的長期性及穩(wěn)定性，這將是后續(xù)研究的重點。

研究證明，移植的BM-MSCs對缺氧缺血性腦損傷的大鼠的神經(jīng)功能有明確的改善作用。其作用機制主要有“替代學(xué)說”和“營養(yǎng)學(xué)說”?！疤娲鷮W(xué)說”：BM-MSCs移植后可以分化為神經(jīng)元并和宿主原有神經(jīng)細胞建立聯(lián)系，從而改善神經(jīng)功能[13]。“營養(yǎng)學(xué)說”：BM-MSCs移植后主要是通過分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，起到神經(jīng)保護的作用，而使神經(jīng)功能得到改善[14]。但是具體機制仍在進一步研究中。實驗證明，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子可以快速激活休眠的干細胞并促使其生長，同時可以調(diào)節(jié)機體內(nèi)微環(huán)境，為干細胞提供有利的生長條件[15]。神經(jīng)營養(yǎng)因子對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的作用[16]。但是正常腦組織內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達很少，無法在腦損傷后對受損神經(jīng)元起到足夠的修復(fù)與保護作用。

本研究中MSC組各神經(jīng)營養(yǎng)因子表達于移植后第3天開始升高，術(shù)后第21天仍處于明顯高值。說明BM-MSCs移植后，對體內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達有正性刺激作用，以協(xié)助BM-MSCs共同修復(fù)受損神經(jīng)。出現(xiàn)“表達低谷期”的可能機制是由于在移植前3 d損傷組織處于急性水腫期，刺激導(dǎo)致內(nèi)源性因子分泌均顯著增加，水腫逐漸吸收后，刺激因素的消失使各因子分泌逐漸處于平穩(wěn)[17]。由于收集樣本量較小，各神經(jīng)營養(yǎng)因子在各組中的具體變化不能進一步更好地闡述。

本實驗將BM-MSCs移植入缺氧缺血腦損傷大鼠后，結(jié)果顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌增加，協(xié)同BM-MSCs促進受損神經(jīng)元的修復(fù)，相應(yīng)的神經(jīng)功能評分也較移植前改善。(1)BM-MSCs移植后分泌外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，使局部微環(huán)境得到改善，促進外源性BM-MSCs的存活、增殖和分化，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的增加，使神經(jīng)營養(yǎng)因子表達增多[18]；(2)BM-MSCs移植后分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子可能通過自分泌、旁分泌方式促進內(nèi)源性和外源性BM-MSCs的增殖，分化為新的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，細胞數(shù)量的增多促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達增多[19]；(3)損傷的腦組織自身產(chǎn)生的各種營養(yǎng)因子促進內(nèi)源性、外源性BM-MSCs的增殖和分化，從而促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[20-24]。

[1] Wang H,Wu M, Liu Y. Mesenchymal stem cells major sources of safe signals in immune system[J]. Cell Immun,2012, 272(2):112-116.

[2] Vadala G,Studer R K,Sowa G,etal.Coculture of bone marrow mesenchymal stem cells and nucleus pulpous cells modulate gene expression profile without cell fusion[J].Spine, 2008,33(8):870-876.

[3] 劉建新,王曉峰,張榮軍,等.經(jīng)枕大池移植神經(jīng)干細胞治療重型顱腦損傷大鼠的實驗研究[J].臨床神經(jīng)外科雜志,2012,3(9)：133-135.

[4] Satoshi O S, James E G. Multiple cell populations in the early postnatal sub ventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progen it or migration[J].Neuro,2003, 23: 4240-4250.

[5] Wu J S, Dong A P, Wang X C,etal.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the repair of rat spinal cord hemi section injury[J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2010, 18(1):198-207.

[6] Kim S J , Choi S W , Hur K J,etal.Synergistic effect of mesenchymal stem cells infected with recombinant adenovirus expressing human BDNF on erectile function in a rat model of cavernous nerve injury[J].Korean Urol,2012,53 (10): 726-732.

[7] Huang Z Y, Hong L Q, Na N,etal.Infusion of mesenchymal stem cells over expressing GDNF ameliorates renal function in nephrotoxic serum nephritis [J].Cell Biochem Funct, 2012, 30 (2): 139-144.

[8] Motoyoshi Y A, Tamura M, Moriyama M,etal.Activation of cultured atrocities by amphotericin B: Stimulation of NO and cytokines production and changes in neurotrophic factors production [J].Neurochem Int, 2013, 5:232-240.

[9] Yang C，Zhou L，Gao X.Neuroprotective effects of bone marrow stem cells over expressing glial cell line-derived neurotrophic factor on rats with intracerebral hemorrhage and neurons exposed to hypoxia deoxygenating[J].Neurosurgery,2011, 68:691-699.

[10] Benjamin Y，Castillo M. Hypoxic-ischemic brain injury：imaging findings from birth to adulthood[J]. Radiographics，2008，28(2)：417-439.

[11] Sacchetti B, Funari A, Michienzi S,etal. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hema-topoietic microenvironment[J].Cell, 2007,131(2):324-336.

[12] Traggiai E, Volpi S, Schena F,etal. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells induce both polyclonal expansion and differentiation of B cells isolated from healthy donors and systemic lupus erythematosus patients[J].Stem Cells,2008,26(2):562-569.

[13] Chen W H, Liu H Y, Lo W C,etal. Intervertebral disc regeneration in an ex vivo culture system using mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma[J]. Biomaterials,2009,7(19):1-11.

[14] Chongran S,Han Z ,Jin L,etal.Modulation of the major histocompatibility complex by neural stem cell-derived neurotrophic factors used for regenerative therapy in a rat model of stroke[J].J Transl Med,2010,8:77-83.

[15] Lovell M A,Geiger H,Van Zant G E,etal.Isolation of neural precursor cells from Alzheimer's disease and aged control postmortem brain[J].Neurobiol Aging,2006,27(7)：909-917.

[16] Song J,Lee S T,Kang W,etal.Human embryonic stem cell-derived neural precursor transplants attenuate apomorphine-induced rotational behavior in rats with unilateral quinolinic acid lesions[J].Neurosci Lett ,2007,423(1):58-61.

[17] Chu K, Kim M, Park K I ,etal. Human neural stem cells improve sen sori motor deficits in the adult rat brain with experi mental focal ischemia[J]. Brain Res ,2004 , 1016 : 145-153.

[18] Titomanlio L, Kavelaars A, Dalous J,etal. Stem cell therapy for neonatal brain injury: perspectives and challenges[J].Ann Neurol,2011,70(5), 698-712.

[19] Shi W.BDNF blended chitosan scaffolds for human umbilical cord MSC transplants in traumatic brain injury therapy[J].Biomaterials,2012,33:3119-3126.

[20] Li Y, Chopp M, Chen J,etal.Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice[J]. J Cerebr Blood Met,2000, 20(9):1311-1319.

[21] Rempe D A, Kent T A. Using bone marrow stromal cells for treatment of stroke[J]. Neurology,2002, 59(4): 486-487.

[22] Cao Q,Benton R L,Whitomore S R.Stem cell repair of central nervous system injury[J].J Neuroscience RES,2002,68(5):501-510.

[23] Trope P, Noel D, Platet N. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow[J]. Exp Cell Res,2004,29(5): 395-406.

[24] Prabhakaran M P, Venugopal J R, Ramakrishna S.Mesenchymal stem cell differentiation to neuronal cells on electrospun nanofibrous substrates for nerve tissue engineering[J]. Biomaterial,2009, 30: 4996-5008.

(2014-03-01收稿 2014-04-20修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Expressionofneurotrophicfactorsintherapyofbonemarrowmesenchymalstemcellstonewbornratswithseverehypoxicischemicbraindamage

HU Hezhen1,HUA Rongrong2,AN Yihua2,and WANG Xiaodong1,2. 1. Clinical institute of Chinese People’s Armed Police Forces General Hospital of Anhui Medical University,Beijing 100039,China; 2.Stem Cell Department, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

ObjectiveTo study the expression changes in nerve growth factor (NGF) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve nutriment-3 neurotrophin-3 (NT-3), glia cell line - derived neurotrophic factor (GDNF) in the process of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) therapy to newborn rats with severe hypoxic ischemic brain damage and relationship with improvement of neural function.MethodsThe rat models of severe hypoxic ischemic brain damage developed by the right common carotid artery ligation +oxygen deficit(number=60)were divided into stem cell treatment group(MSC group, number=20), the operation control group(NS group, number=20)and blank control group(BC group, number=20) randomly.We transplanted BM-MSCs cultured and amplified in vitro into cerebrospinal fluid of model rats through cisterna magna. Movement of rats was assessed with modified Neurological Severity Scores (mNSS) at day 3, day 7, day 14 and day 21 after transplantation.NS group used the same volume of normal saline instead of BM-MSCs and mNSS evaluation time and method was the same as in MSC group. We established BC group the model with no transplantation and mNSS evaluation time and method was the same with MSC group,examined the expressions of NGF, BDNF, NT - 3and GDNF collected from rats, cerebrospinal fluid at day 3, day 7, day 14 and day 21 after transplantation.ResultsThere was significant difference in mNSS scores between MSC group and NS group at day 7, day 14 and day 21 after transplantation(P<0.05);Scores in MSC group, NS group and BC group were 7±2.8、10±3.7 and 11±1.6, respectively.And BC group had a variation only in day 21 after transplantation(P<0.05). And there was apparent increase in the expression of neurotrophic factors in MSC group at day 3, day 7, day 14 and day 21 after transplantation by cerebrospinal fluid detection(P<0.05).ConclusionsBM - MSCs can promote recovery of neurological function in brain injury rats. NGF、NT-3、BDNF and GDNF play an important role in the process of the recovery of neural function,but the specific mechanism needs further research.

bone marrow mesenchymal stem cells; hypoxic-ischemic brain damage; neurotrophic factor; transplant

國家教育部出國留學(xué)回國人員啟動基金(2011001);廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)項目(2011A081401003)

胡合珍，碩士研究生，E-mail: luoboshidai@163.com

1. 100039北京，安徽醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院臨床學(xué)院；2. 100039北京，武警總醫(yī)院細胞移植科

王曉東，E-mail:xdwang2000@163.com

R457.7