半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預(yù)作用*

趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍

(承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北 承德 067000)

半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預(yù)作用*

趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍△

(承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北 承德 067000)

目的： 探討半枝蓮黃酮(SBF)對大鼠腦室注射β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)結(jié)合三氯化鋁(AlCl3)及重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(rhTGF-β1)(復合Aβ25-35)引起的皮層細胞線粒體膜凋亡相關(guān)蛋白異常的干預(yù)作用。方法: 雄性SD大鼠手術(shù)當天腦室注射10 ng rhTGF-β1，手術(shù)第2天開始腦室分別于上午注射Aβ25-35(4 μg/d，連續(xù)注射14 d)、下午注射1% AlCl3(3 μL/d ，連續(xù)注射5 d)建立神經(jīng)損傷模型。術(shù)后第49天模型成功大鼠隨機分為模型對照組和3個劑量SBF組。藥物組大鼠分別連續(xù)灌胃 SBF (35、70和140 mg/kg)36 d，每日1次。大鼠末次給藥60 min后斷頭處死，蛋白印跡法測定各組大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的蛋白表達水平。結(jié)果: 大鼠腦室注射復合Aβ25-35可使大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，使Bax和Bak蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)。然而，35、70和140 mg/kg SBF灌胃36 d，可以不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致上述改變。結(jié)論: 腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1可引起線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak異常改變，SBF能夠逆轉(zhuǎn)上述凋亡因子異常改變。

半枝蓮黃酮； β-淀粉樣蛋白25-35； 三氯化鋁； 重組人類轉(zhuǎn)化生長因子-β1； 線粒體凋亡通路

目前，神經(jīng)退行性疾病已成為臨床上常見的疾病，神經(jīng)細胞凋亡的加劇被認為是該病主要的現(xiàn)象之一[1]。細胞凋亡是機體正常細胞在受到生理或病理刺激后出現(xiàn)的自發(fā)性死亡，是一個高度有序的、主動的、由基因控制和多種酶參與的程序化死亡過程[2]。研究表明，異常的細胞凋亡與很多疾病如炎癥、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。根據(jù)細胞凋亡的啟動，細胞凋亡分為線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路和死亡受體通路。線粒體凋亡通路是細胞凋亡中一條非常重要的通路，凋亡刺激通過線粒體膜上的一系列凋亡因子產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞凋亡，特別是Bcl-2家族中抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL及促凋亡因子Bax、Bak異常表達在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ具有較強的神經(jīng)毒性，腦室投放Aβ肽段可以誘發(fā)動物神經(jīng)病理學改變，包括神經(jīng)細胞凋亡[6]。如果結(jié)合鋁和重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(recombinant human transforming growth factor β1, rhTGF-β1)建立多因素神經(jīng)損傷，更能較全面模擬臨床神經(jīng)病變病人的病理生理特征[7-8]。半枝蓮黃酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是從半枝蓮(ScutellariabarbataD. Don)地上部分分離的黃酮類化合物，以野黃芩苷為主。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SBF具有解熱、抗菌、抗突變和抗氧化等多種功效，對去勢大鼠記憶障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌及腦內(nèi)自由基異常變化以及Aβ25-35對星形膠質(zhì)細胞的損害具有明顯的治療作用[9-11]，但對Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1(復合Aβ25-35)引起動物神經(jīng)損害、特別是線粒體凋亡通路中線粒體膜上的凋亡因子的影響尚未見報道。本實驗利用大鼠腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1建立神經(jīng)損害模型，探討SBF對復合Aβ模型大鼠皮層細胞線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bak和Bcl-xL異常變化的干預(yù)結(jié)果。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與藥品

清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(合格證編號：90912)體重300～350 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于承德醫(yī)學院實驗動物中心，手術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食，12 h光照明/暗交替。半枝蓮黃酮由本實驗室制備；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；Aβ25-35由上海強耀生物科技有限公司提供；線粒體/胞漿制備試劑盒 C1260購于北京普利來基因技術(shù)有限公司，其它試劑購于試劑商店。

2 方法

2.1 動物模型的建立 300～350 g健康雄性SD大鼠，實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12小時。腹腔注射10%水合氯醛 (300 mg/kg) 麻醉,常規(guī)消毒，固定于大鼠腦立體定位儀，顱頂正中矢狀切開，暴露硬腦膜，標記前鹵點位置。參照包新民編著《大鼠腦立體定位圖譜》，以前鹵點為坐標原點，于前鹵點后2.0 mm、矢狀縫右側(cè)旁開1.4 mm、深4.6 mm確認丘腦背側(cè)核位置。于前鹵點后1.2 mm、矢狀縫左側(cè)旁開2.0 mm、深4.0 mm確認側(cè)腦室位置，三棱錐鉆一直徑為0.2 mm孔，埋置導管,用硫酸鋅水門汀固定導管。模型對照組側(cè)腦室給藥Aβ25-3514 d，AlCl35 d，給藥速度為1 μL/min，假手術(shù)對照組給予等體積生理鹽水，首次注射時在丘腦前背側(cè)核注入rhTGF-β110 ng?？p合傷口，常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)肌肉注射青霉素每日1次，1次1×105U。歸籠飼養(yǎng)，在手術(shù)第45天利用Morris水迷宮進行4 d的大鼠記憶障礙模型篩選，以第4天水迷宮篩選成績計算，模型對照組大鼠篩選率大于0.2，即為模型成功大鼠，本實驗?zāi)Ｐ统晒β?94.7%。有關(guān)大鼠學習、記憶研究將另文報道。

2.2 實驗動物分組、給藥及樣品制備 在手術(shù)第 49 天，模型成功大鼠隨機分4組，模型對照組和3劑量藥物組，藥物組大鼠連續(xù)用SBF灌胃(每日劑量為35、70和140 mg/kg)36 d，模型對照組和假手術(shù)對照組大鼠給予等體積的生理鹽水。大鼠手術(shù)第85天，即給藥第36天，所有大鼠在給藥60 min后乙醚麻醉，斷頭處死，冰上分離大腦皮層放在1.5 mL無RNA酶的EP管中，凍存于-80 ℃超低溫冰柜中備用。

2.3 Western blotting檢測大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的測定 200 mg皮層組織與1.5 mL Mito Solution反復研磨，800 ×g4℃ 離心5 min，取上清12 000×g4 ℃ 再離心10 min，此時上清液為細胞的胞液成分，在管底的沉淀即為線粒體。

將得到的線粒體加入0.2 mL Mito Solution進行洗滌，12 000×g4 ℃ 離心10 min，棄上清，沉淀加RIPA裂解液，得到線粒體液，利用BCA法測定線粒體蛋白濃度。樣品與上樣buffer混勻，95 ℃ 加熱使蛋白變性，根據(jù)測定的蛋白濃度每孔上樣50 μg，10% SDS-PAGE分離蛋白約1.5 h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜封閉2 h。在Ⅰ抗Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak稀釋液中孵育PVDF膜2 h，TBST洗后置于Ⅱ抗稀釋液孵育1 h，TBST洗后蛋白印跡顯影，膠片掃描后，采用Quantity One 軟件對顯影條帶進行分析，計算Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak條帶與β-actin條帶的體積比和光密度比值，作為它們的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

圖1顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。然而劑量為35、70和140 mg/kg的SBF不同程度地增加了大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2的蛋白表達，與模型組相比，SBF 70和140 mg/kg組的Bcl-2蛋白表達量顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

Figure 1.The effect of SBF on Bcl-2 protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35.Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖1 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

2 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

圖2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax的蛋白表達明顯增加(P<0.01)。然而，劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著降低復合Aβ25-35所致的大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達量的升高(P<0.05或P<0.01)。

Figure 2.The effect of SBF on Bax protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖2 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

3 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達異常的影響

圖3顯示，與假手術(shù)組相比，(P<0.01)。然而，劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著增加注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白的表達量(P<0.05或P<0.01)。

4 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達異常的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮層中Bak蛋白的表達明顯增加(P<0.01)。然而，劑量為35、70和140 mg/kg的SBF顯著降低注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白的表達量(P<0.01)，見圖4。

討 論

流行病調(diào)查顯示，隨著全球人類的老齡化，神經(jīng)退行性病人日益增多，而神經(jīng)細胞凋亡性病理改變是這些病人神經(jīng)病變主要的特征性改變之一[12]。細胞凋亡又稱為細胞程序化死亡，是一個高度主動有序、多個基因和蛋白因子參與調(diào)控的正常的生理活動過程[13]。然而，當細胞遭受病理性刺激后，細胞凋

Figure 3.The effect of SBF on Bcl-xL protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖3 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of SBF on Bak protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

圖4 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達的影響

亡就會異常加劇，而異常的細胞凋亡與一系列疾病包括神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)細胞凋亡是神經(jīng)元丟失的重要原因，Aβ蛋白可以引起神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子失衡，而鈣離子超載與線粒體途徑凋亡有密切關(guān)系。線粒體凋亡路徑為Aβ誘導神經(jīng)細胞凋亡的主要途徑，其中Aβ可引起線粒體的損害和相關(guān)凋亡蛋白的改變。眾所周知，線粒體是機體能量的動力工廠，線粒體的狀態(tài)是否正常直接調(diào)控著細胞的死亡模式，而線粒體通路中相關(guān)凋亡因子在疾病發(fā)生、發(fā)展以及藥物作用研究中發(fā)揮重要作用。線粒體膜上存在著多種與細胞凋亡相關(guān)的重要蛋白因子，Bcl-2家族成員Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xL等嚴格控制著線粒體外膜的通透性，調(diào)控細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)的釋放和細胞凋亡[16]。Bcl-2和Bax是線粒體外膜上一對相互拮抗的細胞凋亡因子，Bcl-2是抗細胞凋亡因子，它能夠降低線粒體膜的通透性，抑制Cyt-C的釋放；Bax是促細胞凋亡因子，正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上，當細胞接受凋亡信號時，Bax則形成二聚體促進Cyt-C的釋放，同時Bcl-2能夠抑制Bax的構(gòu)象改變，阻止Bax二聚體的形成而減少Cyt-C 的釋放。Bak與Bcl-xL是線粒體外膜上又一對互相拮抗的凋亡因子，Bak促進細胞凋亡，Bcl-xL抑制細胞凋亡，Bak和Bcl-xL也是通過影響線粒體外膜的通透性來調(diào)節(jié)Cyt-C釋放，當Bak占優(yōu)勢時Cyt-C自線粒體釋放。當細胞色素C一旦從線粒體釋放到胞液中，Cyt-C則與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activated factor-1，Apaf-1)和caspase-9相互作用，從而激活caspase-3,導致細胞凋亡[17]。

在細胞線粒體凋亡通路中，DNA被降解為片段也是細胞凋亡常見的結(jié)果[18]。有人認為在神經(jīng)退行性病人中最初可能是DNA損傷，然后出現(xiàn)Bcl-2和Bax調(diào)控的改變，直至細胞死亡丟失。更有報道在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中均發(fā)現(xiàn)Bax的表達，表明Bax可能是神經(jīng)元死亡的早期事件[19]。體外研究發(fā)現(xiàn)，Aβ能上調(diào)Bak的表達，下調(diào)Bcl-xL的表達；體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)，Aβ使腦內(nèi)Bak表達增強，使Bcl-xL的表達減少或者沒有明顯影響[20]，故推測Aβ可能通過促進Bak的表達來改變Bak/Bcl-xL之間的平衡，而誘導細胞凋亡。在內(nèi)源性凋亡途徑中，Bcl-2和Bcl-xL可直接在線粒體外膜上形成一種陽離子通道和穩(wěn)定的膜電位，該通道抑制Cyt-C的釋放。Bax和Bak在線粒體外膜上通過空間構(gòu)象的改變形成的通道是一種陰離子通道，而該通道促進Cyt-C的釋放，這樣抗凋亡因子和促凋亡因子在線粒體膜上形成的通道對Cyt-C的釋放起相反的調(diào)控作用[21]。進一步實質(zhì)性的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體Cyt-C的釋放是通過膜滲透性轉(zhuǎn)變孔道復合物(permeability transition pore complex, PTPC)來完成的，Bcl-2家族的凋亡因子直接調(diào)節(jié)著PTPC，而PTPC是一種大分子多蛋白復合體，其大部分組件是電壓依從性陰離子通道，線粒體膜上促凋亡因子Bax和Bak能夠直接打開脂質(zhì)體電壓依從性陰離子通道，消除線粒體膜電位，促進Cyt-C的釋放；線粒體膜上抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL能夠穩(wěn)定膜電位，阻止Cyt-C的釋放[22]。釋放的Cyt-C進一步激活其下游凋亡因子，直至激活最終效應(yīng)因子caspase-3而導致細胞凋亡。

細胞凋亡特別是線粒體凋亡通路介導的細胞凋亡直接參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，因此，任何能夠抑制細胞凋亡的手段，都有利于這些疾病的治療。本研究利用腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1建立多因素神經(jīng)損傷模型，探討大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的變化以及SBF干預(yù)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)大鼠相比，腦室注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯降低、Bax和Bak的蛋白表達明顯增加。Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bak這兩對作用相反的細胞凋亡因子共同促進Cyt-C的釋放，激活其下游的一系列凋亡因子，引發(fā)細胞凋亡。然而，SBF灌胃模型大鼠36 d明顯翻轉(zhuǎn)由復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表達的異常，穩(wěn)定線粒體凋亡通路相關(guān)凋亡因子，抑制Cyt-C的釋放，從而抑制細胞凋亡。

本實驗室以往的研究已經(jīng)證明，SBF能顯著改善去卵巢大鼠學習記憶障礙及免疫、內(nèi)分泌異常，調(diào)節(jié)腦內(nèi)自由基系統(tǒng)，SBF這些作用源于它是黃酮類化合物，具有多羥基結(jié)構(gòu)和較強的還原性，可通過自身氧化阻止膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)過氧化，保證了包括線粒體在內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的完整性和通透性。結(jié)合以往的研究，本實驗提示，SBF改善復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak蛋白異常表達與其對線粒體膜結(jié)構(gòu)的保護密切相關(guān)，而線粒體結(jié)構(gòu)與功能以及線粒體凋亡通路的正常調(diào)節(jié)都參與了SBF 抗細胞凋亡的過程。本研究為SBF可用于神經(jīng)退行性疾病的治療提供了實驗依據(jù)。

[1] 周曉雯, 蘇朝芬, 羅煥敏. 線粒體與神經(jīng)退行性疾病[J]. 神經(jīng)藥理學報, 2011, 1(3):41-46.

[2] 曾耀英. 細胞凋亡分子機制的研究進展[J]. 中國科學基金, 1999(3):137-144.

[3] 劉曉婷, 王延讓, 張 明. 線粒體介導細胞凋亡的研究進展[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2013, 30(2):182-184.

[4] 楊紹杰, 孟金萍, 劉云波. 細胞凋亡信號傳導通路的研究進展[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2007, 17(5):297-300.

[5] 趙美順，陳敬榮，楊 紅. β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性與線粒體功能異常研究進展[J]. 廣東藥學院學報, 2012, 28(6):689-692.

[6] Lustbader JW, Cirilli M, Lin C, et al. ABAD directly links Aβ to mitochondrial toxicity in Alzheimer’s disease[J]. Science, 2004, 304(5669):448-452.

[7] 方 芳, 晏 勇, 馮占輝, 等. 多因素損傷的老年性癡呆動物模型的實驗研究[J]. 重慶醫(yī)學, 2007, 36(2):146-151.

[8] Small DH, Gasperini R, Vincent AJ, et al. The role of Aβ-induced calcium dysregulation in the pathogenesis of Alzheimer’s disease [J]. J Alzheimers Dis, 2009, 16(2):225-233.

[9] 郗玉玲, 張樹峰, 繆 紅, 等. 去卵巢大鼠腦內(nèi)MDA水平、GSH-Px活性及NO濃度的變化及半枝蓮黃酮的干預(yù)作用[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2011, 31(24)：1996-1998.

[10]郗玉玲, 劉敏華, 張曉峰, 等. 半枝蓮黃酮對去卵巢大鼠記憶障礙的改善作用[J]. 中國老年學雜志, 2011, 31(2):242-245.

[11]范 悅, 吳曉光, 趙泓翔，等. 半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞NOS、HSP70及apoE 異常表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):359-363.

[12]王友政，叢 瀟，王 磊，等. 阿爾茨海默病中Aβ?lián)p傷線粒體的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):2259-2263．

[13]孫 博, 費洪新，姜 波, 等. 阿爾茨海默病發(fā)病機制初探[J]. 中醫(yī)藥信息, 2014，31(3):26-29.

[14]Pimplikar SW. AβPP, apoptosis and Alzheimer’s disease[J]. J Alzheimers Dis，2002, 4(1):39-40.

[15]Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002, 297(5580):353-356.

[16]朱玉山, 陳 佺. 線粒體與細胞凋亡調(diào)控[J]. 生命科學, 2008, 20(4):506-513.

[17]Qu M, Zhou Z, Chen C, et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition pore opening is involved in the protective effects of mortalin overexpression against beta-amyloid-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Neurosci Res, 2012, 72(1):94-102.

[18]Kapoor R, Rizvi F, Kakkar P. Naringenin prevents high glucose-induced mitochondria-mediated apoptosis involving AIF, Endo-G and caspases[J]. Apoptosis, 2013, 18(1):9-27.

[19]Chipuk JE, Moldoveanu T, Llambi F, et al. The BCL-2 family reunion [J]. Mol Cell, 2010, 37(3):299-310.

[20]許茸茸, 李應(yīng)東. Bcl-2家族與線粒體凋亡通路相互作用研究進展[J]. 中國老年學雜志, 2013, 33(12):2977-2979.

[21]Howells CC, Baumann WT, Samuels DC，et al. The Bcl-2-associated death promoter (BAD) lowers the threshold at which the Bcl-2-interacting domain death agonist (BID) triggers mitochondria disintegration [J]. J Biol Chem, 2011, 271(1):114-123.

[22]Gogvadze V, Orrenius S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death[J]. Chem Biol Interact, 2006, 163(1-2):4-14.

Effect ofScutellariabarbataflavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35

ZHAO Hong-xiang, GUO Ke, CUI Ya-di, WU Xiao-guang, SHANG Ya-zhen

(InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,HebeiProvinceKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopment,HebeiProvincialResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineAgainstDementia,Chengde067000,China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

AIM: To study the abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bax in the cell mitochondrial membrane of cerebral cortex in the rats injected with β-amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) in combination with aluminum trichloride (AlCl3) and recombinant human transforming growth factor β1(rhTGF-β1) (composite Aβ25-35) into lateral cerebral ventricle, and to explore the intervention ofScutellariaBarbataflavonoids (SBF). METHODS: The male SD rats were used to establish the neuronal damaged model by receiving injection of rhTGF-β1 1 μL (10 ng) on day 1 of operation, and then from day 2 of operation, intracerebroventricular injection of Aβ25-35(4 μg/d， consecutive 14 d) in the morning and 1% AlCl3in the afternoon (3 μL/d， consecutive 5 d). On the day 49 of operation, the successful model rats were randomly divided into model control and 3 doses of SBF groupss. The rats in SBF groups were daily orally administered with SBF at doses of 35, 70 and 140 mg/kg for 36 d. All the rats were decapitated 60 min after the last administration. The protein expression of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane was detected by Western blotting. RESULTS: The composite Aβ25-35dramatically caused decreases in Bcl-2 and Bcl-xL (P<0.05), and increases in Bax and Bak (P<0.01) in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane. However, oral treatment with SBF for 36 d reversed the above disorders induced by composite Aβ25-35. CONCLUSION: The composite Aβ25-35induces the expression abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in mitochondrial membrane and SBF reverses the above disturbances of apoptotic factors.

Scutellariabarbata flavonoids; β-Amyloid beta protein 25-35; Aluminum trichloride; Recombinant human transforming growth factor β1; Mitochondrial apoptosis pathway

1000- 4718(2014)12- 2262- 05

2014- 06- 23

2014- 09- 17

河北省自然科學基金資助項目(No. C2009001007； No. H2014406048)；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(No. 05027)；河北省高校重點學科建設(shè)項目

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.026

△通訊作者Tel: 0314-2290616; E-mail: shangyz1018@sina.com