小檗堿與育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究*

賈寶銀， 楊多猛， 王 媛， 李紅梅， 余小慧， 呂秀秀， 陸大祥， 王華東

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

小檗堿與育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究*

賈寶銀， 楊多猛， 王 媛， 李紅梅， 余小慧， 呂秀秀， 陸大祥， 王華東△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

目的： 探討小檗堿與育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法: 采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)構(gòu)建小鼠膿毒癥模型，分為假手術(shù)(sham)組、CLP組、CLP+小檗堿組、CLP+育亨賓組、CLP+小檗堿與育亨賓合劑組。CLP術(shù)后2 h灌胃給予相應(yīng)藥物，20 h后取脾臟，用TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞凋亡，酶熒光法檢測(cè)caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性變化，Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Fas、Bim、Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果: (1) CLP組脾臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著高于sham組(P<0.05)，CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組凋亡細(xì)胞百分率顯著低于CLP組(P<0.05)。(2) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CLP組凋亡的脾細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞明顯多于sham組(P<0.05)，CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組凋亡的脾細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞明顯少于CLP組 (P<0.05) 。(3) CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組脾細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均低于CLP組(P<0.05)；而CLP+小檗堿組脾細(xì)胞caspase-9活性也低于CLP組 (P<0.05)。(4) CLP+育亨賓與小檗堿合劑組胞漿Fas、Bim、Bax表達(dá)均低于CLP組，CLP+育亨賓組胞漿Fas表達(dá)低于CLP組，CLP+小檗堿治療組胞漿Bim、線粒體Bax表達(dá)均低于CLP組。結(jié)論: (1) 小檗堿與育亨賓合用可通過(guò)阻斷內(nèi)、外源性凋亡途徑抑制膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡，特別是T淋巴細(xì)胞凋亡。(2) 育亨賓主要通過(guò)抑制Fas的表達(dá)、進(jìn)而阻斷內(nèi)、外源性凋亡途徑減少膿毒癥誘導(dǎo)的脾細(xì)胞凋亡。(3) 小檗堿可抑制膿毒癥小鼠脾細(xì)胞線粒體凋亡途徑，但對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡的抑制作用并不明顯。

小檗堿； 育亨賓； 細(xì)胞凋亡； 膿毒癥； 脾淋巴細(xì)胞

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit, ICU)病人死亡的重要原因之一[1]，膿毒癥病人在膿毒癥后期常常出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制，容易發(fā)生醫(yī)院內(nèi)二次感染[2]。目前的研究顯示，大量的淋巴細(xì)胞凋亡導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力降低以及免疫功能障礙、繼而引發(fā)院內(nèi)感染是膿毒癥患者后期死亡的重要原因[3]。然而，目前臨床治療膿毒癥的主要方法仍然是應(yīng)用抗生素治療相關(guān)感染以及血液動(dòng)力學(xué)和器官支持等對(duì)癥治療。因此，尋求一種有效抑制膿毒癥患者淋巴細(xì)胞凋亡的方法，對(duì)于改善膿毒癥病人的免疫抑制狀況和預(yù)后尤為重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)小檗堿(berberine, B)和α2-腎上腺素能受體(α2-adrenoceptor, α2-AR)阻斷劑育亨賓(yohimbine,Y) 聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率[4]，但是小檗堿和育亨賓聯(lián)用是否能抑制膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡？其機(jī)制如何？迄今尚缺乏深入的研究。因此，本研究觀察小檗堿和育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其作用的分子機(jī)制，為闡明小檗堿和育亨賓聯(lián)合應(yīng)用治療膿毒癥的機(jī)制提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)為SCXK(粵)2008-0002:44007200005475，8～10周齡，體重20～25 g之間。小鼠每籠5只，分籠飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食及飲水。待其適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在(25 ±2) ℃，濕度控制在60%～80%。小鼠進(jìn)行分組處理：假手術(shù)組(sham組)，術(shù)后2 h用超純水(0.1 mL/10 g體重)灌胃；膿毒癥模型組，即盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP )組，CLP術(shù)后2 h用超純水(0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+小檗堿組(CLP+B)，術(shù)后2 h用小檗堿(50 mg/kg，0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+育亨賓組(CLP+Y)，術(shù)后2 h用育亨賓(2 mg/kg，0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+小檗堿與育亨賓合劑組(CLP+BY)，術(shù)后2 h用小檗堿(50 mg/kg)與育亨賓(2 mg/kg)配制成BY合劑(0.1 mL/10 g體重)灌胃。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定的要求。

2 主要試劑

中性硫酸小檗堿、育亨賓均購(gòu)自Sigma；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche；凋亡檢測(cè)試劑盒：Annexin V-FITC Apoptosis detection Kit、T淋巴細(xì)胞特異性表面流式抗體Anti-Mouse CD3e APC、B淋巴細(xì)胞特異性表面流式抗體Anti-Human/Mouse CD45R PE-Cy7、封閉抗體Anti-Mouse CD16/32 Purified(FcR Block)均購(gòu)自eBioscience；Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit購(gòu)自Promega；Caspase-8/FLICE Fluorometric Assay Kit、Caspase-9 Fluorometric Assay Kit均購(gòu)自BioVision；線粒體提取試劑盒Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells、兔抗小鼠 Fas Antibody購(gòu)自Santa Cruz；兔抗小鼠 Bim Antibody、兔抗小鼠 Bax Antibody、兔抗小鼠 Bcl-2 Antibody、兔抗小鼠GAPDH Antibody、兔抗小鼠VDAC Antibody均購(gòu)自Cell Signaling。

3 主要方法

3.1 C57BL/6小鼠膿毒癥模型的建立 小鼠麻醉后，對(duì)其腹部皮膚手術(shù)區(qū)進(jìn)行消毒，沿腹白線行正中切口，開(kāi)腹后，小心分離并提拉盲腸置于洞巾上，避開(kāi)腸系膜大血管于盲腸末端約2/3處結(jié)扎盲腸，以12號(hào)針貫穿盲腸，來(lái)回穿刺5次，注意穿孔時(shí)避開(kāi)腸壁血管，回納腸管，依次關(guān)腹縫合，手術(shù)切口消毒，對(duì)合切口兩側(cè)邊緣腹壁與皮膚。術(shù)后在小鼠背部皮下注射無(wú)菌生理鹽水(0.3 mL /10 g)。

3.2 脾組織冰凍切片制備及TUNEL染色 術(shù)后20 h麻醉并處死小鼠，將脾臟組織置于4%多聚甲醛中固定24 h。再用冰PBS液沖洗后依次放于10%蔗糖溶液6 h，20%蔗糖溶液過(guò)夜，30%蔗糖溶液24 h進(jìn)行脫水，PBS清洗組織后置于包埋盒中，加入OCT膠，調(diào)節(jié)切片厚度為5 μm，使用冰凍切片機(jī)，將組織塊修整后切片。用防脫載玻片貼取組織切片放于37 ℃烤箱，12 h后將組織載玻片置于濕盒中，用0.3% PBST液室溫孵育5 min，重復(fù)3次穿孔破膜，使用5% BSA室溫孵育30 min進(jìn)行封閉。PBST洗片3次后每張玻片上加125 μL TUNEL工作液，使其全部覆蓋樣本，37 ℃避光孵育1 h。PBST洗片3次， DAPI染核并滴加抗熒光淬滅劑，將蓋玻片蓋在載玻片上后做好標(biāo)記，在蓋玻片周圍封指甲油，選取所需要的熒光通道，以及適合的激發(fā)波長(zhǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察。

3.3 脾臟T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞凋亡染色 CLP術(shù)后20 h，麻醉后處理小鼠，無(wú)菌取出脾臟立即放入盛有適量預(yù)冷的10% FCS RPMI-1640液中，運(yùn)用沖洗法將脾細(xì)胞沖出并用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，去除雜質(zhì)，使用碧云天ACK紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用1 mL新鮮含10% FCS的RPM-I1640液重懸細(xì)胞，并細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×1010/L。從上述細(xì)胞懸液取200 μL，加入封閉抗體anti-mouse CD16/32，冰上孵育5～10 min后加入anti-mouse CD3e APC、anti-mouse CD45R PE-Cy7抗體混合液孵育抗體，4 ℃避光孵育30 min。保持細(xì)胞密度為2×108～5×108/L，離心去上清。加5 μL Annexin V及1 × binding buffer 195 μL,輕微吹打混勻后，室溫避光孵育10 min。用1× binding buffer 200 μL洗去殘留的Annexin V。再加1 × binding buffer 190 μL及10 μL PI，重懸后立即使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.4 脾細(xì)胞caspase-3、8、9活性測(cè)定 術(shù)后20 h處死小鼠，將1 mL脾細(xì)胞懸液每樣本分為500 μL、250 μL、250 μL以分別測(cè)定caspase-3、8、9的活性。Caspase活性檢測(cè)分別按照說(shuō)明書依次檢測(cè)，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值相對(duì)熒光單位(relative fluorescence units,RFU )。同時(shí)分別測(cè)定樣品的蛋白濃度。

3.5 Western blotting檢測(cè)脾細(xì)胞Fas、Bcl-2、Bim的表達(dá)以及線粒體Bax水平 術(shù)后20 h處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，并應(yīng)用線粒體試劑盒進(jìn)行線粒體分離。然后將胞漿蛋白加入5 × loading buffer加熱變性；而線粒體沉淀加入70 μL RIPA裂解液裂解之后加入5 × loading buffer加熱變性。其中，胞漿蛋白用來(lái)檢測(cè)Fas、Bim和Bcl-2，線粒體蛋白用來(lái)檢測(cè)Bax。運(yùn)用SDS凝膠電泳，采用恒流(35 mA/凝膠)電泳，根據(jù)蛋白分子量確定電泳時(shí)間，如小分子蛋白電泳時(shí)間最好30 min以內(nèi)，20 kD以上蛋白電泳在30～40 min。轉(zhuǎn)膜條件：18 V，7 min(蛋白分子量>20 kD)；15 V，6 min(蛋白分子量<20 kD)。GAPDH作為胞漿蛋白內(nèi)參照，線粒體蛋白內(nèi)參照是VDAC。電泳后切取所需目的蛋白及內(nèi)參照蛋白膠條，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、抗體孵育、經(jīng)過(guò)化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組方差齊時(shí)，兩兩組間比較采用LSD法；各組方差不齊時(shí)，兩兩比較用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TUNEL檢測(cè)結(jié)果

術(shù)后20 h小鼠脾臟冰凍切片TUNEL染色，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，各組結(jié)果如圖1所示。藍(lán)色為脾細(xì)胞核，綠色為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，二者重合代表細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，CLP術(shù)后20 h，脾臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P< 0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組脾細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于CLP組(P< 0.05)，而CLP+B組與CLP組相比，脾細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 1.Effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on sepsis-induced splenocyte apoptosis in C57BL/6 mice. Splenocyte apoptosis was detected by TUNEL 20 h after CLP. Mean ±SEM.n=10～12.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖1 小檗堿和(或)育亨賓對(duì)膿毒癥術(shù)后20 h小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響

2 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

從圖可以看出，CLP術(shù)后20 h， CLP組與假手術(shù)組相比，早期凋亡的脾細(xì)胞顯著增多(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組早期凋亡細(xì)胞的百分率均顯著低于CLP組(P<0.05)，而CLP+B組與CLP比較，早期凋亡細(xì)胞的百分率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。對(duì)T淋巴細(xì)胞早期凋亡百分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CLP術(shù)后20 h， CLP組早期凋亡T淋巴細(xì)胞的百分率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，早期凋亡的T淋巴細(xì)胞均明顯減少(P<0.05)，而CLP+B組與CLP比較，早期凋亡的T淋巴細(xì)胞百分率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CLP術(shù)后20 h， CLP組早期凋亡的脾臟B淋巴細(xì)胞顯著多于假手術(shù)組(P<0.05)；CLP+Y組與CLP組比較，早期凋亡的B淋巴細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，而CLP+B組、CLP+BY組分別與CLP組比較，早期凋亡的B淋巴細(xì)胞百分率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Figure 2.Effects of berberine(B)or/and yohimbine(Y)on sepsis-induced splenocyte, T and B lymphocyte apoptosis in C57BL/6 mice. Lymphocyte apoptosis 20 h after CLP or sham operation was detected by flow cytometric analysis using staining with Annexin V-FITC/PI. Mean± SEM.n=12～15.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖2 小檗堿和(或)育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞及脾T和B淋巴細(xì)胞凋亡的影響

3 各組小鼠脾細(xì)胞caspase-3、8和9活性的變化

由圖3可以看出，CLP組與假手術(shù)組比較，caspase-3活性顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，caspase-3活性均顯著降低(P<0.05),而CLP+B組與CLP組比較，caspase-3活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CLP組與假手術(shù)組比較，脾細(xì)胞caspase-8的活性顯著升高(P<0.05)；CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，caspase-8酶活性均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CLP+B組與CLP組比較，脾細(xì)胞caspase-8的活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 術(shù)后20 h，CLP組脾細(xì)胞caspase-9的活性明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組、CLP+B組分別與CLP組比較，脾細(xì)胞caspase-9的活性均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 3.Effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on caspase-3, caspase-8 and caspase-9 activities of splenocytes in C57BL/6 mice at 20 h after CLP. Mean±SEM.n=12～15.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖3 小檗堿和(或)育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞caspase-3、8和9活性的影響

4 各組小鼠脾細(xì)胞Fas、Bcl-2、Bim的表達(dá)及線粒體Bax水平的變化

從圖4可以看出，C57BL/6小鼠在復(fù)制膿毒癥模型20 h后，脾細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。CLP+Y組、CLP+BY組脾細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)均低于CLP組(P<0.05)，而CLP+B組的Fas蛋白表達(dá)與CLP組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CLP組與假手術(shù)組相比，Bim表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。CLP+B組、CLP+BY組Bim表達(dá)量均明顯低于CLP組(P<0.05)，而CLP+Y組與CLP組相比，Bim表達(dá)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。CLP術(shù)后20 h，小鼠脾細(xì)胞Bcl-2 的表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)。應(yīng)用小檗堿和(或)育亨賓治療的CLP小鼠，CLP術(shù)后20 h脾細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 表達(dá)量與CLP組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CLP組脾細(xì)胞線粒體Bax蛋白含量與假手術(shù)組相比顯著增高(P<0.05)。CLP+B組、CLP+BY組的脾細(xì)胞線粒體Bax蛋白含量均明顯低于CLP組(P<0.05)；CLP+Y組的脾細(xì)胞線粒體Bax蛋白含量與CLP組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

討 論

膿毒癥是一種感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征[5]。雖然臨床治療措施不斷改進(jìn)，但是膿毒癥患者的死亡率一直居高不下，因此膿毒癥仍是極具挑戰(zhàn)性的臨床問(wèn)題[5-6]。通常, 膿毒癥患者的免疫功能受損，尤其在膿毒癥后期，可出現(xiàn)脾臟與胸腺等器官淋巴細(xì)胞凋亡[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí) T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的凋亡嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[9]。因此，通過(guò)某種手段調(diào)節(jié)膿毒癥患者淋巴細(xì)胞凋亡將是具有價(jià)值的治療方法。

我們先前研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿與育亨賓聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率[4]。本研究采用CLP復(fù)制膿毒癥模型，術(shù)后20 h觀察這些藥物對(duì)脾細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥術(shù)后20 h小鼠脾細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，包括T、B淋巴細(xì)胞；單用育亨賓、育亨賓與小檗堿合劑均能明顯抑制膿毒癥引起的小鼠脾細(xì)胞凋亡、特別是T淋巴細(xì)胞凋亡。而單用小檗堿，并不能顯著抑制膿毒癥引起的脾細(xì)胞凋亡，也不能抑制膿毒癥誘導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞凋亡。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，單用育亨賓可以抑制膿毒癥誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞凋亡。研究已經(jīng)證實(shí)，淋巴細(xì)胞上存在α2腎上腺素能受體，育亨賓能阻斷α2腎上腺素能受體的活化[10]。這些結(jié)果提示, 淋巴細(xì)胞上α2腎上腺素能受體可能直接或間接調(diào)節(jié)膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，阻斷α2腎上腺素能受體活化可能是抑制膿毒癥患者淋巴細(xì)胞凋亡的一種新策略。

很多研究表明，死亡受體(外源性)途徑和線粒體(內(nèi)源性)途徑均參與了膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡。例如，F(xiàn)as蛋白可介導(dǎo)膿毒癥誘導(dǎo)的CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡[11]；Schwulst等[12]發(fā)現(xiàn)抑制bim基因的表達(dá)可阻斷膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，顯著改善存活。此外，bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠的脾淋巴細(xì)胞凋亡可以完全被抑制[13]；IL-15可阻止NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bim和PUMA的表達(dá)，提高膿毒癥小鼠的生存率[14]。本研究進(jìn)一步探討了育亨賓和小檗堿對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠脾細(xì)胞Fas的表達(dá)明顯上調(diào)，caspase-8的活性明顯升高；同時(shí)，膿毒癥小鼠脾細(xì)胞中Bim的表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，線粒體Bax水平明顯升高，脾細(xì)胞caspase-9活性增強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明，膿毒癥誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制與內(nèi)、外源性凋亡途徑有關(guān)。育亨賓單用可以顯著降低膿毒癥小鼠脾細(xì)胞中Fas的表達(dá)，并且caspase-8和caspase-3活性也顯著降低，說(shuō)明育亨賓可能通過(guò)作用于外源性凋亡途徑發(fā)揮抗膿毒癥淋巴細(xì)胞凋亡的作用。有趣的是，單用育亨賓后，膿毒癥小鼠脾細(xì)胞caspase-9的活性也顯著降低，但是育亨賓并不能抑制膿毒癥誘導(dǎo)的脾細(xì)胞Bim的表達(dá)，也不能降低膿毒癥小鼠脾細(xì)胞線粒體中Bax的水平，這可能是育亨賓在小鼠體內(nèi)通過(guò)抑制caspase-8裂解Bid，從而導(dǎo)致caspase-9的活性顯著降低。單用小檗堿后，膿毒癥小鼠脾細(xì)胞Bim表達(dá)下調(diào)、線粒體Bax蛋白的含量降低，且caspase-9的活性也相應(yīng)降低，但是對(duì)Fas蛋白的表達(dá)和caspase-8及caspase-3活性沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果提示：小檗堿僅僅抑制細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，對(duì)外源性凋亡途徑?jīng)]有影響，但總體上并不足以抑制膿毒癥誘導(dǎo)的脾細(xì)胞凋亡。

Figure 4.The effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on Fas, Bim, Bcl-2 expression and mitochondrial Bax content of splenocytes in C57BL/6 mice at 20 h after subjected to CLP. Mean±SEM.n=12～15.*P<0.05vssham;#P<0.05vsCLP. GAPDH was used as the cytoplasm reference protein and voltage-dependent anion channel protein (VDAC) was used as the mitochondrial reference protein.

圖4 小檗堿和(或)育亨賓對(duì)膿毒癥小鼠脾細(xì)胞胞漿Fas、Bim、Bcl-2表達(dá)及線粒體Bax含量的影響

雖然，Chang等[15]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥引起的淋巴細(xì)胞凋亡中，內(nèi)、外源性2條凋亡途徑的交叉作用確實(shí)扮演了極其重要的角色， 但目前并沒(méi)有確定內(nèi)、外源性凋亡途徑在膿毒癥引起的脾細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的程度。我們的研究發(fā)現(xiàn)，育亨賓單用可以顯著降低膿毒癥小鼠脾細(xì)胞中Fas的表達(dá)、caspase-8和caspase-3的活化和脾細(xì)胞凋亡，而小檗堿能抑制膿毒癥引起的脾細(xì)胞caspase-9的活化，但不能顯著抑制膿毒癥引起的脾細(xì)胞caspase-3的活化和脾細(xì)胞凋亡。 這些結(jié)果提示，在膿毒癥引起的脾細(xì)胞凋亡中，外源性凋亡途徑(Fas的表達(dá))的活化可能發(fā)揮更大程度的作用。

我們進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，小檗堿與育亨賓合用后能顯著抑制膿毒癥小鼠脾細(xì)胞凋亡，不但能顯著降低Fas的表達(dá)，而且顯著降低Bim的表達(dá)、減少線粒體Bax的含量，顯著降低caspase-8、9、3的活化，因而小檗堿與育亨賓合劑可能同時(shí)通過(guò)作用于內(nèi)、外源性兩條凋亡途徑抑制膿毒癥脾細(xì)胞的凋亡。

盡管本研究初步探討了小檗堿與育亨賓發(fā)揮抗膿毒癥淋巴細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制， 但是本研究尚存在很多不足之處。例如，本研究?jī)H限于內(nèi)、外源性凋亡途徑，而且2條途徑的信號(hào)分子研究也不全面；膿毒癥淋巴細(xì)胞的凋亡還涉及其它途徑的作用，體內(nèi)給予α2腎上腺素能受體阻斷劑通過(guò)何種環(huán)節(jié)抑制膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，尚未闡明。因此，這些藥物作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] Mayr FB, Yende S, Angus DC. Epidemiology of severe sepsis[J]. Virulence， 2014, 5(1): 4-11.

[2] Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis [J]. N Engl J Med，2003, 348(2): 138-150.

[3] Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D. Immunosuppression in sepsis: a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach [J]. Lancet Infect Dis, 2013, 13(3): 260-268.

[4] Li H, Wang Y, Zhang H, et al. Yohimbine enhances protection of berberine against LPS-induced mouse lethality through multiple mechanisms [J]. PLoS One, 2012, 7(12): e52863.

[5] Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. ACCP/SCCM Con-sensus Conference Committee, American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine [J]. Chest, 1992, 101(6):1644-1655.

[6] Marshall JC. Clinical trials of mediator-directed therapy in sepsis: what have we learned? [J]. Intensive Care Med, 2000, 26 (Suppl 1): S75-S83.

[7] Perl M, Chung CS, Perl U, et al. Fas-induced pulmonary apoptosis and inflammation during indirect acute lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007, 176(6): 591-601.

[8] 欒櫻譯， 姚詠明. 膿毒癥中免疫負(fù)調(diào)控途徑的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011，27(3): 616-619，624.

[9] Hotchkiss RS, Tinsley KW, Swanson PE, et al. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+T lymphocytes in humans[J]. J Immunol, 2001, 166 (11): 6952-6963.

[10]Bao JY, Huang Y, Wang F, et al. Expression of alpha-AR subtypes in T lymphocytes and role of the alpha-ARs in mediating modulation of T cell function[J]. Neuroimmunomodulation，2007，14(6): 344-353.

[11]Ayala A, Chung CS, Xu YX, et al. Increased inducible apoptosis in CD4+T lymphocytes during polymicrobial sepsis is mediated by Fas ligand and not endotoxin[J]. Immunology, 1999, 97(1): 45-55.

[12]Schwulst SJ, Muenzer JT, Peck-Palmer OM, et al. Bim siRNA decreases lymphocyte apoptosis and improves survival in sepsis [J]. Shock, 2008, 30(2): 127-134.

[13]Hotchkiss RS, Swanson PE, Knudson CM, et al. Overexpression of Bcl-2 in transgenic mice decreases apoptosis and improves survival in sepsis [J]. J Immunol, 1999, 162(7): 4148-4156.

[14]Inoue S, Unsinger J, Davis CG, et al. IL-15 prevents apoptosis, reverses innate and adaptive immune dysfunction, and improves survival in sepsis [J]. J Immunol, 2010, 184(3): 1401-1409.

[15]Chang KC, Unsinger J, Davis CG, et al. Multiple triggers of cell death in sepsis: death receptor and mitochondrial-mediated apoptosis [J]. FASEB J, 2007, 21(3):708-719.

Effects of berberine and yohimbine on splenocyte apoptosis in septic mice

JIA Bao-yin, YANG Duo-meng, WANG Yuan, LI Hong-mei, YU Xiao-hui, Lü Xiu-xiu, LU Da-xiang, WANG Hua-dong

(DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,KeyLaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofThePeople’sRepublicofChina,Guangzhou510632,China.E-mail:owanghd@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of berberine and yohimbine on splenocyte apoptosis in septic mice and underlying mechanisms. METHODS: The mice were subjected to cecal ligature and puncture (CLP). The drugs or vehicle were given intragastrically 2 h after the surgery according to the following 5 groups: sham, CLP, CLP+berberine, CLP+yohimbine, and CLP+berberine+yohimbine. The apoptosis of splenocytes stained by TUNEL was observed under laser scanning confocal microscope 20 h after CLP. The splenic lymphocytes were isolated and observed using flow cytometry. The activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 in splenic lymphocytes were detected, and the expression of Fas, Bim, Bcl-2 and Bax in the splenocytes was also determined by Western blotting. RESULTS: The TUNEL staining showed that the apoptotic rate of the splenocytes in septic mice 20 h after CLP was significantly higher than that in sham and CLP+yohimbine groups (P<0.05). Compared with CLP group, the proportion of apoptotic cells was decreased in septic mice in CLP+berberine+yohimbine and CLP+yohimbine groups (P<0.05). Flow cytometry analysis demonstrated the similar results in the apoptosis of splenocytes and T lymphocytes. However, only yohimbine treatment reduced the apoptosis of B lymphocytes in the spleen of sepsis-challenged mice. Compared with CLP group, caspase-9 activity was significantly reduced in CLP+berberine group (P<0.05), the activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were all statistically reduced (P<0.05) in CLP+yohimbine group and CLP+yohimbine+berberine group. CLP significantly increased the expression of cytosolic Fas, Bim and mitochondrial Bax in the splenocytes, and decreased Bcl-2 expression compared with sham group. Compared with CLP group, the expression of cytosolic Bim and mitochondrial Bax in CLP+berberine group were reduced (P<0.05). Fas expression decreased only in CLP+yohimbine group (P<0.05). Berberine combined with yohimbine reduced the expression of cytosolic Fas, Bim and mitochondrial Bax in the septic mouse splenocytes (P<0.05).CONCLUSION: Yohimbine reduces sepsis-induced splenic lymphocyte apoptosis in mice by inhibiting Fas expression and in turn blocking both extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. Berberine reduces Bim expression and inhibits caspase-9 activation, but not caspase-3 activation and apoptosis in the septic mouse splenocytes. Berberine combined with yohimbine reduces splenocyte apoptosis in the septic mice by inhibiting both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.

Berberine; Yohimbine; Apoptosis; Sepsis; Splenocytes

1000- 4718(2014)12- 2206- 07

2014- 09- 09

2014- 10- 30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30971191； No.81170222)；廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.S2011020005408)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.12C22071599)

R285.5； R163+.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.016

△通訊作者 Tel: 020-85220241; E-mail: owanghd@jnu.edu.cn