MicroRNA-132轉(zhuǎn)染對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用*

藍(lán)琳友， 洪溪屏， 蔡元暉

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院急診科，浙江 麗水 323000)

MicroRNA-132轉(zhuǎn)染對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用*

藍(lán)琳友△， 洪溪屏， 蔡元暉

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院急診科，浙江 麗水 323000)

目的： 探討轉(zhuǎn)染微小RNA-132(miR-132)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。方法: 將體外去致熱源培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組，分別采用miR-132增敏劑、錯(cuò)義鏈和PBS作用。轉(zhuǎn)染24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞増殖；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-132的表達(dá)；用脂多糖(LPS)作用細(xì)胞后，凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB活性；Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的表達(dá)。結(jié)果: 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-132的表達(dá)明顯升高；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞増殖被明顯抑制，與空白對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS作用后，轉(zhuǎn)染組NF-κB、TNF-α和IL-6表達(dá)量顯著下降，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: 轉(zhuǎn)染miR-132可抑制NR8383細(xì)胞増殖，并抑制LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

MicroRNA-132； 肺泡巨噬細(xì)胞； 炎癥反應(yīng)

近年來(lái)研究表明，微小RNA(microRNAs, miRNAs)作為內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在組織炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、組織分化和腫瘤形成等多種生理過(guò)程起重要調(diào)節(jié)作用[1]。其中miR-132是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，miR-132不僅在病毒感染及免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]，另外在LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)中，miR-132的表達(dá)與炎癥因子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[4]，表明miR-132可能作為抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新作用靶點(diǎn)。為進(jìn)一步明確miR-132調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，本研究觀察轉(zhuǎn)染miR-132對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞NR8383生長(zhǎng)和炎癥因子表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

胎牛血清、Ham’s F-12K培養(yǎng)基和0.25% EDTA胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)自R&D；EMSA試劑盒購(gòu)自Pierce；TNF-α、IL-6和β-actin抗體購(gòu)自Epitomics；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；CyTM3標(biāo)記miRNA-132 mimic和miRNA-132錯(cuò)義鏈購(gòu)自銳博生物科技有限公司；Trizol和PCR引物購(gòu)自Invitrogen；Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ABI。

2 細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼胺纸M

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在含15%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham’s F-12K培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NR8383細(xì)胞按4×106/well接種到6孔板，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后分3組：(1)空白對(duì)照組：在培養(yǎng)基中加入濃度為50 nmol/L的Lipofectamine 2000和PBS；(2)陰性對(duì)照組：每孔加入50 nmol/L的CyTM3標(biāo)記miRNA-132錯(cuò)義鏈；(3)轉(zhuǎn)染組：在培養(yǎng)基中加入濃度為50 nmol/L 的CyTM3標(biāo)記miRNA-132 mimic。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-132的表達(dá)，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后再加入濃度為1 mg/L的LPS。細(xì)胞放入培養(yǎng)箱6 h后離心收集細(xì)胞，置于-80 ℃冰箱。

3 主要方法

3.1 Real-time PCR檢測(cè)NR8383細(xì)胞中miR-132的表達(dá) 用Trizol試劑提取總RNA，按說(shuō)明書操作?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm與280 nm處吸光度比值(A260/A280)為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA純度。采用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。以U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-132的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后的各組NR8383細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔200 μL，細(xì)胞貼壁后放置培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞，加入等量的PBS)。培養(yǎng)結(jié)束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 mL后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測(cè)A450值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對(duì)照組A450值-空白調(diào)零組A450值)×100%。

3.3 Western blotting檢測(cè)NR8383細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達(dá) 裂解細(xì)胞并分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20 μg)，常規(guī)8% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性Ⅰ抗(1∶1 000)于4 ℃下孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件分析，以β-actin為內(nèi)參照，通過(guò)與內(nèi)參照的灰度比得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

3.4 EMSA實(shí)驗(yàn) 裂解細(xì)胞后提取核蛋白。EMSA實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，探針序列為: 5′-TACTAGCTAGTTCGTGTCAG-3′，將6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠在電壓為120 V條件下恒壓電泳60 min，取10 μg核蛋白加入超純水中室溫反應(yīng)30 min后再加入生物素標(biāo)記探針，在室溫下反應(yīng)30 min后電泳100 min再印跡轉(zhuǎn)移，用帶正電荷尼龍膜380 mA恒流電轉(zhuǎn)40 min，轉(zhuǎn)移完后將尼龍膜至于紫外燈下交聯(lián)15 min，將膜再用30 mL封閉液在室溫下反應(yīng)20 min，最后將膜放入平衡液中反應(yīng)15 min，化學(xué)發(fā)光顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件分析，計(jì)算灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，正態(tài)分布變量多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染

NR8383細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染CyTM3標(biāo)記miR-132后，綠色熒光激發(fā)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中的CyTM3發(fā)射出紅光，在倒置熒光顯微鏡下觀察，在NR8383細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量顆粒狀熒光，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Morphology of the rat alveolar macrophages NR8383 were observed under the fluorescence microscopy after transfected with miR-132 mimic (×100).

圖1 熒光顯微鏡下觀察CyTM3標(biāo)記miR-132轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞的結(jié)果

2 各組NR8383細(xì)胞中miR-132的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明，在空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組中miR-132的相對(duì)表達(dá)量分別為5.84±2.03、6.92±1.83和23.34±5.17。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染組中miR-132的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-132 in NR8383 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group；#P<0.05vsnegative control group.

圖2 miR-132在各組NR8383細(xì)胞中的表達(dá)

3 CCK-8法檢測(cè)各組NR8383細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在各個(gè)時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速度均明顯低于空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 轉(zhuǎn)染miR-132對(duì)NR8383細(xì)胞中NF-κB活性的影響

各組NR8383細(xì)胞中均有不同程度的NF-κB活性表達(dá)，LPS作用后可顯著上調(diào)NR8383細(xì)胞中NF-κB的活性；與空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組相比較，NF-κB活性在轉(zhuǎn)染組中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.CCK-8 assay was used to determine the proliferation of NR8383 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblack control group；#P<0.05vsnegative control group.

圖3 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-132對(duì)NR8383細(xì)胞增殖的影響

Figure 4.The NF-κB DNA-binding activity in NR8383 cells was measured by EMSA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖4 EMSA檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-κB活性

5 Western blotting檢測(cè)TNF-α和IL-6在NR8383細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比較，LPS作用后NR8383細(xì)胞中TNF-α和IL-6的水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TNF-α和IL-6在轉(zhuǎn)染組的水平較空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組顯著下降，有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Western blotting analysis of TNF-α and IL-6 in NR8383 cells. β-actin protein served as loading control.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖5 Western blotting檢測(cè)TNF-α和IL-6在NR8383細(xì)胞中的表達(dá)

討 論

肺泡巨噬細(xì)胞在肺損傷時(shí)被激活，肺泡巨噬細(xì)胞不但可吞噬侵入肺臟的炎癥粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質(zhì)參與中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的遷徙過(guò)程，因此在急性肺損傷過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[6]。LPS是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要致病成分，也是膿毒癥主要致病因素，在膿毒血癥過(guò)程中，LPS可活化肺泡巨噬細(xì)胞Toll樣受體/核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)炎癥通路，導(dǎo)致大量炎癥因子如TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1釋放，最終引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的發(fā)生[7-8]。TNF-α作為炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早和最重要的炎癥介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其它組織代謝活性并促使其它細(xì)胞因子的合成和釋放，而IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑[9]。在本研究采用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383來(lái)建立炎癥反應(yīng)模型，并檢測(cè)NF-κB、TNF-α和IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)判斷模型是否建立成功和炎癥反應(yīng)程度。本研究結(jié)果表明，LPS作用NR8383細(xì)胞后，活化NF-κB表達(dá)增加，同時(shí)TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，從而成功建立起炎癥反應(yīng)模型，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合[4]。

miRNAs是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過(guò)特異性識(shí)別靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)位點(diǎn)而抑制蛋白翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[1-3]。近年來(lái)研究表明miRNAs在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。有研究表明，轉(zhuǎn)染miR-146a后可下調(diào)巨噬細(xì)胞中多種炎癥因子的表達(dá)[10]；而miR-132作為當(dāng)前微小RNA研究的熱點(diǎn)之一，劉芬等[4]觀察到肺泡巨噬細(xì)胞miR-132表達(dá)上調(diào)后可下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，同時(shí)miR-132的表達(dá)在炎癥性腸病中的表達(dá)明顯高出正常腸組織中的表達(dá)[3]，從而表明miR-132與肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，但尚未有轉(zhuǎn)染miR-132對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用報(bào)道。在本研究中，NR8383細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染CyTM3標(biāo)記miRNA-132后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光激發(fā)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中的CyTM3發(fā)射出紅光，同時(shí)轉(zhuǎn)染組NR8383細(xì)胞中miRNA-132表達(dá)明顯上調(diào)，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞miRNA-132成功；在分析轉(zhuǎn)染miRNA-132后對(duì)NR8383細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)中，CCK-8結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-132后對(duì)NR8383細(xì)胞增殖有明顯抑制作用；另外本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-132到巨噬細(xì)胞后觀察到miR-132的表達(dá)明顯增加，同時(shí)上調(diào)miR-132可顯著下調(diào)NF-κB、TNF-α和IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，從而首次表明miR-132可通過(guò)Toll樣受體/ NF-κB炎癥通路抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究成功建立起LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，轉(zhuǎn)染miR-132至巨噬細(xì)胞后可抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制炎癥因子NF-κB、TNF-α和IL-6的表達(dá)，表明miR-132可通過(guò)Toll樣受體/ NF-κB炎癥通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。

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藍(lán)斑核的線粒體氧化應(yīng)激受活性一氧化氮合成酶的調(diào)控

去甲腎上腺素能(noradrenergic, NA)藍(lán)斑核(locus coeruleus, LC)神經(jīng)元支配大腦的大多數(shù)部位，保持大腦的醒覺(jué)狀態(tài)，并在興奮和緊張時(shí)期調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)和可塑性。LC的缺失是老齡化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)的主要特征。為了探討引起這類疾病的可能的生理因素，作者采用電生理學(xué)的方法和光鏡研究小鼠大腦切片，觀察小鼠LC神經(jīng)元的異常變化。作者發(fā)現(xiàn)由于L型Ca2+通道的開(kāi)放，LC神經(jīng)元的自主活動(dòng)伴隨著Ca2+濃度的擺動(dòng)而變化。這種Ca2+濃度的擺動(dòng)可以增強(qiáng)線粒體的氧化應(yīng)激，但一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)受到抑制時(shí)，Ca2+濃度的振幅相應(yīng)衰減，氧化應(yīng)激也相應(yīng)減弱。覺(jué)醒和二氧化碳都可以增加LC神經(jīng)元的放電率，但它區(qū)別于線粒體氧化應(yīng)激的影響，可見(jiàn)活動(dòng)和應(yīng)激之間的關(guān)系具有延展性。在PD的動(dòng)物模型中，同樣可以觀察到氧化應(yīng)激有增加的趨勢(shì)。因此，根據(jù)研究結(jié)果，作者指出活性依賴的Ca2+通道和所產(chǎn)生的線粒體氧化應(yīng)激是加重LC神經(jīng)元損傷的重要因素，并受NOS的調(diào)控。

Nat Neurosci, 2014, 17(6):832-840(劉紫萍)

Effect of microRNA-132 transfection on lipopolysaccharide-induced inflammation in rat alveolar macrophages

LAN Lin-you, HONG Xi-ping, CAI Yuan-hui

(EmergencyDepartment,TheFifthAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Lishui323000,China.E-mail:lanlinyou2013@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-132 (miR-132) transfection on the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in rat alveolar macrophages. METHODS: The rat alveolar macrophage NR8383 cultured without pyrogeninvitrowere divided into blank control group, negative control group and transfected group. The cells in the 3 groups were transfected with phosphate buffer solution (PBS), Lipofectamine 2000 and synthesized miR-132 mimic respectively. The cell proliferation was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Real-time PCR was used to detect the expression of miR-132 in the cells. After NR8383 cells were stimulated with LPS for 6 h, the NF-κB DNA-binding activity was measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in NR8383 cells was assayed by Western blotting.RESULTS: After transfection, the expression of miR-132 was significantly higher than that in blank control group and negative control group. The growth of NR8383 cells in transfected group was significantly inhibited compared with blank control group and negative control group (P<0.05). After the cells were stimulated with LPS, the productions of NF-κB, TNF-α and IL-6 in transfected NR8383 cells were decreased compared with blank control group and negative control group (P<0.05).CONCLUSION: Transfection of alveolar macrophages with miR-132 significantly suppresses the cell growth, and inhibits inflammatory responses induced by LPS.

MicroRNA-132； Alveolar macrophages； Inflammatory response

1000- 4718(2014)12- 2190- 05

2014- 06- 16

2014- 09- 16

浙江省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No. 2012A122)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.013

△通訊作者 Tel： 0578-2129120； E-mail： lanlinyou2013@163.com