血漿中多基因聯(lián)合甲基化檢測(cè)在肺癌診斷中的應(yīng)用*

丁 浩， 沈志高， 李 昊， 邱 宇， 郝曉寧， 祖金池， 鐘 理, 2△

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物芯片研究室，河北 保定 071002； 2Western University of Health Science，California 91766，USA; 3河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071002)

血漿中多基因聯(lián)合甲基化檢測(cè)在肺癌診斷中的應(yīng)用*

丁 浩1， 沈志高1， 李 昊1， 邱 宇1， 郝曉寧1， 祖金池3， 鐘 理1, 2△

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物芯片研究室，河北 保定 071002；2Western University of Health Science，California 91766，USA;3河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071002)

目的： 探究血漿中CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13等抑癌基因啟動(dòng)子甲基化及其聯(lián)合檢測(cè)在肺癌診斷中的價(jià)值。從中選出診斷效能高的組合。方法: 采用巢式甲基化特異性PCR(nest methylation specific PCR，nMSP)法，檢測(cè)106例健康人血漿樣本、106例肺癌組織和癌旁組織以及其對(duì)應(yīng)的106例術(shù)前血漿樣本、中基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。對(duì)血漿基因組DNA修飾后進(jìn)行多重置換擴(kuò)增 (multiple displacement amplification, MDA)，以解決血漿DNA模板不足的問題。結(jié)果: 肺癌組織樣本中的CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13基因啟動(dòng)子甲基化率分別為51.9%、44.3%、54.7%、36.8% 、24.5%。對(duì)應(yīng)的血漿樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9、RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化率分別為46.2%、41.5%、50.9%、31.1%、19.8%。Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明肺癌組織與血漿的甲基化檢出率一致。CDH13、DLEC1、RASSF1A、SEPT9組合對(duì)肺癌的診斷效能明顯高于其它組，準(zhǔn)確度ACC為82.08%，Youden指數(shù)為0.6415(靈敏度為79.49%，特異度為81.13%)。結(jié)論: 血漿多基因聯(lián)合甲基化檢測(cè)有望應(yīng)用于肺癌早期診斷。

肺腫瘤； 血漿； 組織； 甲基化

肺癌是我國發(fā)病率和致死率最高的癌癥之一[1]。由于診斷手段的限制，大多患者在確診時(shí)已發(fā)展到中晚期，取得肺癌組織標(biāo)本會(huì)給患者身體造成很大傷害，難以進(jìn)行病理檢測(cè)。因此，亟需一種能實(shí)時(shí)、有效、無創(chuàng)的檢測(cè)手段，進(jìn)行肺癌的診斷。肺癌的發(fā)生是各種遺傳信息改變和環(huán)境因素累積作用的結(jié)果。表觀遺傳學(xué)研究表明，肺癌的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化相關(guān)[2]。CpG島的異常高甲基化是導(dǎo)致人類抑癌基因的轉(zhuǎn)錄失活的機(jī)制之一，在所有人的血漿中均存在，由于應(yīng)激反應(yīng)所致，其在病人血漿中含量顯著高于健康人[3]。肺癌患者血漿中的循環(huán)DNA主要來源于腫瘤細(xì)胞[4]，其分子生物學(xué)特征與原發(fā)灶相一致[5]。因此，檢測(cè)血漿中相關(guān)抑癌基因的甲基化，有望成為臨床上肺癌診斷的有效手段。

本研究采用巢氏甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)肺癌患者血漿(術(shù)前)、健康人血漿、肺癌組織和癌旁組織中 H-鈣黏素 13 (H-cadherin 13，CDH13)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 3，RUNX3)、ras相關(guān)區(qū)域家族(ras-associated domain family 1A，RASSF1A)、DLEC1 (deleted in lung and esophageal cancer 1)及 septin 9(SEPT9)等抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化狀況?？偨Y(jié)各基因甲基化狀態(tài)與肺癌臨床診斷的關(guān)系，比較2種取材檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，探究血漿作為臨床取材的可行性，探討各基因作為肺癌診斷標(biāo)志物的可能性，綜合靈敏度和特異性，選擇一組基因甲基化標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌臨床診斷。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

材料均取自術(shù)前未經(jīng)放化療，且無其它腫瘤病史的肺癌患者。收集2013年2月～2014年10月保定市第一中心醫(yī)院和河北大學(xué)附屬醫(yī)院106例肺癌患者的肺癌組織、癌旁組織(距癌組織> 3cm)以及術(shù)前血液樣本，其中男72例，女34例；年齡35～84歲，中位年齡61歲。另采集106份健康人血液樣品作對(duì)照。

2 樣品的收集處理

肺癌組織標(biāo)本收集后立即放入液氮中，之后放置于超低溫冰箱。血液樣本用枸櫞酸鈉藍(lán)色真空采血管收集，采血6 h內(nèi)4 000 r/min離心10 min分離血漿；取上清，4 ℃條件下，再次以10 000 r/min離心15 min獲得血漿，用1.5 mL離心管以每管200 μL分裝。

3 主要方法

3.1 基因組DNA的提取 采用DNAiso reagent(TaKaRa)提取組織中的基因組DNA，血漿DNA的提取按照QI Aamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)的血液或體液檢測(cè)方案進(jìn)行，用50 μL AE 洗脫 DNA。Nanodrop 2000C及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)濃度純度，A260/A280值為1.79～1.87。

3.2 基因組DNA的修飾 采用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research)每次修飾1 μg組織基因組DNA，200 ng血漿基因組DNA，用10 μL M-Elution buffer洗脫。

3.3 血漿DNA多重置換擴(kuò)增 (multiple displacement amplification，MDA) 使用Epi Tect Whole Bisulfitome Kit擴(kuò)增試劑盒(Qiagen)對(duì)修飾后的血漿DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。

3.4 巢氏甲基化特異性PCR及電泳檢測(cè) 運(yùn)用Methprimer 軟件設(shè)計(jì)nMSP的引物序列。在重亞硫酸鹽測(cè)序(bisulfite sequencing PCR，BSP)條件下設(shè)計(jì)外側(cè)引物，在甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)條件下分別設(shè)計(jì)甲基化(M)引物和非甲基化(U)引物。引物由蘇州金唯智公司合成，引物序列、產(chǎn)物大小和退火溫度等見表1。LA Taq with GC buffer(TaKaRa)，25 μL反應(yīng)體系：LA Taq 0.25 μL，2×GC bufferⅡ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，修飾后的DNA模板0.5 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.75 μL，加入ddH2O定容至25 μL。第1輪PCR的反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，各基因按各自溫度 30 s，72 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。第1輪PCR后，取5 μL產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像檢測(cè)。第2輪PCR反應(yīng)，取0.5 μL第1輪PCR產(chǎn)物作為模板(稀釋50倍)，取10 mmol/L的甲基化、非甲基化上下游引物各1 μL，退火溫度見表1，其它條件相同擴(kuò)增30次，電泳檢測(cè)。以經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶M.SssI(Zymo Research)處理的健康人外周血單核細(xì)胞DNA作陽性對(duì)照，未經(jīng)M.SssI處理的健康人外周血單核細(xì)胞DNA作陰性對(duì)照，以ddH2O代替模板作為空白對(duì)照。

4 甲基化結(jié)果判斷

第1輪PCR出現(xiàn)條帶；第2輪PCR甲基化引物出現(xiàn)條帶，非甲基化引物未出現(xiàn)條帶，該基因啟動(dòng)子區(qū)判斷為甲基化。甲基化引物、非甲基化引物PCR均出現(xiàn)條帶(部分甲基化)，亦判斷為甲基化。甲基化引物未出現(xiàn)條帶，非甲基化引物出現(xiàn)條帶，則判斷為未甲基化。

表1 引物序列

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件對(duì)各基因甲基化的情況進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)肺癌樣本各基因甲基化狀態(tài)與臨床各種病理因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。Fisher精確檢驗(yàn)比較肺癌組織和癌旁組織各基因甲基化率的差異性；Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)血漿和肺癌組織檢驗(yàn)結(jié)果的一致性。靈敏度(%)=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；κ>0.75為兩者具有一致性。

結(jié) 果

1 各樣本DNA甲基化檢測(cè)結(jié)果

首先用外側(cè)引物分別進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，結(jié)果所有DNA樣本均可擴(kuò)增出相應(yīng)片段。然后分別用甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，結(jié)果顯示106例肺癌組織樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分別為51.9%、44.3%、54.7%、36.8%和24.5%。106例癌旁組織樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分別為10.4%、7.6%、5.7%、10.4%和11.3%。106例血漿樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分別為46.2%、41.5%、50.9%、31.1%和19.8%。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。各基因nMSP的凝膠電泳結(jié)果見圖1。肺癌組織和癌旁組織各基因的甲基化率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中RUNX3基因在2種組織中的甲基化檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CDH13、RASSF1A、DLEC1和SEPT9的甲基化檢出率在2種組織中的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明肺癌組織與血漿的甲基化率一致性明顯，見表3。

Figure 1.nMSP results ofCDH13 (A),RUNX3 (B),RASSF1A(C),DLEC1 (D),SEPT9 (E).

圖1CDH13、RUNX3、RASSF1A、DLEC1、SEPT9 基因的nMSP結(jié)果

表2 肺癌和癌旁組織中的基因甲基化情況

Table 2.Methylation frequencies for lung cancer and paracancerous tissues (%.n=106)

GeneCancertissuesParacanceroustissuesCDH1351.9**10.4**DLEC154.7**5.7**RASSF1A44.3**7.6**SEPT936.8**10.4**RUNX324.5*11.3*

TableP<0.05，**P<0.01vsnormal.

表3 肺癌組織與血漿甲基化率的相關(guān)性

Table 3.The correlation of methylation detection rates between plasma and the corresponding pathological tissues of the patients with lung cancer

Plasma CancertissuesMUKappavalueCDH13M4720.812△ U849DLEC1M5400.924△△ U448RASSF1AM4130.827△ U656SEPT9M3120.790△ U865RUNX3M1920.755△ U778

△κ>0.75，△△κ>0.90vsplasma.

2 各基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺癌組織CDH13甲基化率腺癌組高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組(M1)其CDH13甲基化率高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組(M0)(P<0.05)。原發(fā)腫瘤大小>T2的患者其RASSF1A甲基化率高于其它組(P<0.05)。DLEC1甲基化率鱗癌組高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組(M1)其DLEC1甲基化率高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組(M0)(P<0.05)。各基因甲基化與其它臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)(P>0.05)，見表4。

3 血漿中多基因聯(lián)合甲基化檢測(cè)的靈敏度和特異度

ROC曲線分析顯示，DLECI+CDH13+RASSF1A+SEPT9組的診斷準(zhǔn)確度和Youden指數(shù)最高，分別為82.08%和64.15%。表明本研究中，血漿中DLEC1、CDH13、RASSF1A和SEPT9組合對(duì)肺癌的診斷效能明顯高于其它組(靈敏度為81.13%，特異度為83.02%)，見表5。

肺癌患者的CpG島甲基化表型 (CpG island methylator phenotype， CIMP)陽性(同一樣本存在3個(gè)及3個(gè)以上基因甲基化)率為57.55%。83.96% 的肺癌血漿樣本至少檢測(cè)到1個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化；健康對(duì)照組的CIMP陽性率為9.43%；23.58%的健康人血漿樣本至少檢測(cè)到1個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，見表6。

表4 各基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

TableP<0.05vsnormal.

表5 血漿中各基因組合甲基化的受試者工作曲線(ROC)分析

表6 肺癌患者和健康人血漿中CpG島甲基化表型(CIMP)的比較

Table 6.Comparison of CIMP between the plasma of lung cancer patients and normal controls

CIMPLungcancerpatientsNormalcontrols+57.55%(61/106)9.43%(10/106)-42.45%(45/106)90.57%(96/106)

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素共同作用的復(fù)雜過程。癌癥的產(chǎn)生經(jīng)過2條途徑：一是原癌基因的高表達(dá)，二是抑癌基因的低表達(dá)[6]。后者除與基因突變相關(guān)外，主要與表觀遺傳修飾有關(guān)，而DNA甲基化正是表觀遺傳修飾的主要形式[7]。DNA甲基化在腫瘤發(fā)生的早期即出現(xiàn)，在病灶未形成時(shí)，肺癌患者的血液及胸腔積液中可發(fā)現(xiàn)，且伴隨著腫瘤發(fā)展的整個(gè)過程，DNA甲基化有望成為診斷肺癌的分子標(biāo)志物。CDH13、RUNX3、DLEC1、RASSF1A、SEPT9基因高甲基化在多種癌癥(包括肺癌)均檢測(cè)到[8-9]。但該5種基因未在同一樣本中同時(shí)檢測(cè)過，采用聯(lián)合檢測(cè)，可以有效提高標(biāo)志物的靈敏度和特異度，旨在選出高效能肺癌分子標(biāo)志物組合。血漿中的游離DNA主要來源于腫瘤細(xì)胞本身，本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了循環(huán)無細(xì)胞DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)與肺癌組織在診斷效能上相關(guān)性，證明血漿是一種理想的DNA甲基化檢測(cè)材料。因?yàn)樵谀倪^程中白細(xì)胞破裂釋放的DNA會(huì)對(duì)cfDNA造成干擾，故在本研究中不使用血清[10]。

MSP是檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的常用方法，但是其靈敏度低，不適用于游離DNA的甲基化檢測(cè)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用 nMSP的方法，先用非特異性外側(cè)引物做1輪擴(kuò)增；再分別用特異性內(nèi)側(cè)甲基化引物和非甲基化引物做2輪擴(kuò)增，能提高檢測(cè)的靈敏性和特異性。血漿中DNA的含量極少，陳潔等[12]測(cè)得正常對(duì)照組血漿DNA水平為(14.1±3.8) μg/L，肺癌組血漿DNA水平為15.3 μg/L～1 771.2 μg/L，經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾，模板DNA又會(huì)損失一部分。而近年興起的多重置換擴(kuò)增技術(shù)能通過全基因組擴(kuò)增解決DNA模板濃度過低的難題[13]。為了保證血漿樣本PCR的成功率，我們?cè)谘獫{基因組硫酸氫鹽修飾前都進(jìn)行全基因擴(kuò)增，取得了理想的實(shí)驗(yàn)效果。

CDH13編碼黏附分子，在細(xì)胞黏附、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。CDH13表達(dá)下調(diào)，能降低癌細(xì)胞的黏附力，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)M1組的甲基化率與M0組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CDH13基因甲基化可能是造成肺癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要原因。CDH13基因甲基化還與病理組織類型有關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)腺癌的甲基化率顯著高于其它的病理組織類型。

RASSF1A是常見的抑癌基因，其通過阻斷細(xì)胞周期蛋白D1的積累，導(dǎo)致蛋白激酶失活，從而阻止細(xì)胞分裂周期G1/S的進(jìn)展，調(diào)控細(xì)胞周期[15]。本研究采用nMSP法測(cè)得血漿RASSF1A甲基化率為41.51%，這與Lee 等[16]用焦磷酸測(cè)序法測(cè)得的結(jié)果44.7%基本一致。但Lee的研究結(jié)果顯示吸煙患者的RASSF1A甲基化率高于非吸煙患者。而本研究得到的結(jié)果與其并不一致，可能與樣本數(shù)量和來源不同有關(guān)。

Levanon等[17]首先于1994年在急性髓性白血病中發(fā)現(xiàn)RUNX3基因。RUNX3蛋白是TGF-β信號(hào)通路的重要參與者，RUNX3表達(dá)下調(diào)會(huì)限制Smad功能進(jìn)而影響該細(xì)胞信號(hào)通路的失調(diào)，使細(xì)胞增殖受控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。但該基因在肺癌中研究的并不多，Naoki等[19]用MSP法在NSCLC血漿中測(cè)得RUNX3的甲基化率為20%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中19.81%的甲基化率一致。

DLEC1于1999年由Dalgo等[20]首次克隆發(fā)現(xiàn)，可能是Ser/Thr蛋白激酶信號(hào)通路中某一靶基因。DLEC1在肺癌中的研究很多，DLEC1甲基化是重要的肺癌分子標(biāo)志物，其甲基化往往引起該基因表達(dá)下調(diào)[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLEC1基因甲基化與病理組織類型、是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。鱗癌的甲基化率顯著高于其它病理組織類型，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者DLEC1的甲基化率與未轉(zhuǎn)移的患者相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Lofton等[22]研究發(fā)現(xiàn)SEPT9甲基化是顯著的結(jié)腸癌標(biāo)志物，SEPT9基因的表達(dá)下調(diào)與啟動(dòng)子區(qū)域的高度甲基化相關(guān)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和遷移。Powrózek等[23]用實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR的方法，測(cè)得游離SEPT9作為甲基化標(biāo)志物在肺癌診斷中的靈敏性為44.3%，特異性為92.0%，說明SEPT9作為抑癌基因?qū)Ψ伟┰\斷具有價(jià)值。本研究測(cè)得血漿游離SEPT9在肺癌診斷中的的靈敏性為31.13%，特異性為90.6%，與前人的結(jié)果略有差異，這是由于試驗(yàn)方法的靈敏度和樣本來源差異造成的。

本實(shí)驗(yàn)在肺癌組織和血漿中CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3這5種基因的甲基化狀態(tài)是基本一致的。且血漿中CDH13、RASSF1A、DLEC1和SEPT9組合的準(zhǔn)確度ACC為82.08%，Youden指數(shù)為0.6415(靈敏度:79.49%，特異度:81.13%)，證明了血漿基因甲基化檢測(cè)在臨床肺癌篩查方面的可行性。而這種檢測(cè)方法實(shí)時(shí)微創(chuàng)，能大大減輕患者痛苦。因此，日后的研究重點(diǎn)在于擴(kuò)大樣本量，以提高結(jié)果的科學(xué)性，并用高通量的手段篩選高靈敏度和特異度的DNA甲基化組合。相信不久的將來，血漿多基因的聯(lián)合甲基化檢測(cè)將廣泛應(yīng)用于肺癌的早期診斷中。

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Application of multiple gene methylations in plasma for diagnosis of lung cancer

DING Hao1, SHEN Zhi-gao1, LI Hao1, QIU Yu1, HAO Xiao-ning1, ZU Jin-chi3, ZHONG Li1, 2

(1LaboratoryofBiochipofLifeScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China;2WesternUniversityofHealthScience,California91766,USA;3AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071002,China.E-mail:zhong_leehd@sina.com)

AIM: To determine the aberrant methylation status in the gene promoter regions ofCDH13,RASSF1A,DLEC1,SEPT9 andRUNX3 by detecting the plasma specimens and the value of their combined detection for diagnosis of lung cancers. METHODS: Nest methylation specific PCR (nMSP) was used to detect the promoter methylation status of the 5 genes in the plasma from 106 normal controls， lung cancer tissues, lung benign tissues and the plasma from 106 patients with lung cancers. Multiple displacement amplification (MDA) was used to amplify modified genomic DNA to solve the problem of insufficient of plasma DNA template. RESULTS: The positive rates of promoter methylation ofCDH13,RASSF1A,DLEC1,SEPT9 andRUNX3 in the lung cancer tissues were 51.9%, 44.3%, 54.7%, 36.8%, 24.5%, respectively, and those in the plasma were 46.2%, 41.5%, 50.9%, 31.1%, 19.8%, respectively. The results of the Kappa consistency check showed that the lung cancer tissues and the plasma had obviously coherence in the methylation status of the 5 gene promoter regions. Combination ofDLEC1,CDH13,RASSF1A, andSEPT9 had a higher diagnostic efficiency than the others, as their ACC value was 0.8208 and youden index was 0.6415 (with the sensitivity of 81.13% and the specificity of 83.02%). CONCLUSION: Combination detection of promoter methylation of lung cancer-related genes in the plasma is expected to apply to the early diagnosis of lung cancer.

Lung neoplasms; Plasma; Tissues; Methylation

1000- 4718(2014)12- 2128- 07

2014- 07- 01

2014- 10- 22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272444; No. 81472744)

R446.1； R734.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.003

△通訊作者 Tel: 0312-5079365; E-mail: zhong- leehd@sina.com