靶向ER-α36的vshRNA真核表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及其對胃癌細(xì)胞增殖的影響*

王緒明， 黃 萱， 付政祺， 鄒 豐， 張尚昆， 王兆一， 劉麗江△

(江漢大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室， 2江大病理診斷所組織病理診斷部，湖北 武漢 430056)

·論 著·

靶向ER-α36的vshRNA真核表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及其對胃癌細(xì)胞增殖的影響*

王緒明1, 2， 黃 萱1, 2， 付政祺1, 2， 鄒 豐1， 張尚昆1， 王兆一1， 劉麗江1, 2△

(江漢大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2江大病理診斷所組織病理診斷部，湖北 武漢 430056)

目的： 針對雌激素受體(ER)-α36基因的特異性靶序列, 構(gòu)建并鑒定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒載體，研究ER-α36沉默后對胃癌細(xì)胞增殖的影響。方法: 篩選確定的ER-α36 基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，與慢病毒載體(GV307)連接，測序鑒定。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，感染胃癌SGC7901細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察SGC7901感染后熒光表達(dá)情況，real-time PCR和Western blotting方法檢測ER-α36的表達(dá)變化。用1×10-10mol/L 的17β-雌二醇處理沉默ER-α36的SGC7901細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)法觀察細(xì)胞增殖能力的變化及檢測相關(guān)下游信號通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表達(dá)的變化。結(jié)果: 陽性克隆PCR及測序證明成功構(gòu)建慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi，倒置顯微鏡下觀察LV-ER-α36-RNAi慢病毒載體感染率達(dá)80%以上。 Real-time PCR和Western blotting方法證實四環(huán)素(TeT)誘導(dǎo)下LV-ER-α36-RNAi明顯抑制SGC7901細(xì)胞內(nèi)ER-α36 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。與對照組相比，沉默ER-α36的SGC7901細(xì)胞增殖能力減弱，Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表達(dá)明顯降低，Src蛋白活化能力減弱(P<0.05)。結(jié)論: 我們構(gòu)建的TeT誘導(dǎo)靶向ER-α36的vshRNA慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi，可明顯沉默ER-α36的表達(dá)，為研究ER-α36蛋白的作用機(jī)理提供實驗依據(jù)，ER-α36與胃癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。

SGC7901細(xì)胞； 雌激素受體α36； 慢病毒載體

雌激素受體α36(estrogen receptor α36，ER-α36)是新近發(fā)現(xiàn)的ER-α (又稱ER-α66)的亞型，由310個氨基酸組成，分子量35.7 kD，其基因編碼序列位于人類染色體6q 24.2～25.3(GenBank ID: BX640939.1)，目前的研究發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞膜。ER-α36與ER-α66不同的是擁有一段特有的氨基酸序列，即在末端有27個氨基酸與ER-α66不同。由此針對這個區(qū)段的氨基酸可獲得特異性的ER-α36抗體，使得對ER-α36蛋白的研究變得更為容易[1]。

近10年的研究有越來越多的證據(jù)顯示，雌激素在雌激素依賴性腫瘤(如乳腺癌等)以及雌激素非依賴性腫瘤(呼吸道及消化道腫瘤等)中均發(fā)揮著非常重要的作用[2-7]，其中ER-α36在乳腺癌的耐藥方面和雌激素非依賴性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展方面可能比ER-α66發(fā)揮更為重要的介導(dǎo)雌激素信號的作用[2, 8-10]。為了進(jìn)一步闡明ER-α36蛋白的作用原理以及在腫瘤細(xì)胞信號傳遞中的效應(yīng)機(jī)制，敲減其表達(dá)是重要的體外研究手段之一。因此，我們探索構(gòu)建靶向ER-α36的慢病毒短發(fā)夾狀RNA (vshRNA)真核表達(dá)載體的技術(shù)問題，以解決敲減腫瘤細(xì)胞內(nèi)ER-α36的表達(dá)，研究其介導(dǎo)雌激素信號的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；人胃癌細(xì)胞株SGC7901由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室饋贈；大腸桿菌菌株DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；XhoI、EcoR I及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs；RNA干擾慢病毒載體TetIIP-Turbo-RFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin(GV307)和病毒包裝質(zhì)粒、GV307重組載體、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；感染試劑Lipofectamine 2000(11668019)購自Invitrogen；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Hyclone；兔多克隆抗人ER-α36抗體由王兆一教授(美國，Creighton大學(xué)醫(yī)學(xué)院)饋贈；兔抗人Src 抗體、p416-Src 抗體、 p527-Src 抗體、兔抗人cyclin D1 抗體、兔抗人ERK1/2 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz；鼠單克隆抗體β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；用于Western blotting檢測的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL和BCA蛋白定量試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PVDF轉(zhuǎn)印膜購自Millipore；One Step Reverse Transcript-PCR試劑盒為Qiagen產(chǎn)品；SYBR Master Mixture 購自TaKaRa；四環(huán)素(tetracycline，TeT)粉劑購自中國生物制品研究所；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純；1，5-二甲基-1，5、二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene；感染添加劑)由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；引物的合成及DNA序列測定均委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

2 主要方法

2.1 靶向ER-α36的vshRNA設(shè)計和構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫獲得ER-α36 (BX640939.1)的序列，設(shè)計合成多對針對ER-α36基因shRNA的寡核苷酸序列，選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點(AGC AGA GTG GTA CGG TTA A)進(jìn)入后續(xù)實驗流程。確定針對目的基因shRNA的有效靶點后，合成雙鏈DNA，與GV307載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取重組陽性克隆行PCR及測序鑒定(ABI公司3730型DNA測序儀進(jìn)行測序分析)。挑選轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，混勻取1 μL作為模板；使用GV307載體通用引物，進(jìn)行菌落PCR鑒定實驗。PCR鑒定陽性克隆的上游引物為5’-AGA CCT ACG TCG AGC AGC AC-3’， 下游引物為 5’- TCC GTC TCG TGT CTT GTT GC-3’。

2.2 慢病毒包裝 胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，制備慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒的混合溶液[LV-ER-α36-RNAi載體或GV307-NC(GV307-negative control)20 μg，pHelper 1.0(gag/pol元件)載體15 μg，pHelper 2.0(VSVG元件)載體10 μg]，與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻。將稀釋后的質(zhì)粒與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后， PBS洗滌。加入含10%胎牛血清(FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液。經(jīng)離心過濾，即可獲得病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，測定滴度后，分裝-150 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 慢病毒感染 選取人胃癌SGC7901細(xì)胞，以1×105個數(shù)量的細(xì)胞接種于6孔板中，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基體積為2 mL，待細(xì)胞長至70%。將凍存的LV-ER-α36-RNAi病毒顆粒和GV307-NC病毒顆粒取出冰浴融化，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒滴度至1×1011TU/L，按20 μL/well的用量，將含有LV-ER-α36-RNAi載體的慢病毒感染胃癌SGC7901細(xì)胞, 同時以GV307-NC病毒顆粒為對照(vector-control)，均加入終濃度為10 mg/L的polybrene以提高病毒感染效率。

2.4 熒光顯微鏡檢查感染效率及實驗分組 取LV-ER-α36-RNAi以最適感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值感染SGC7901胃癌細(xì)胞株，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h。根據(jù)感染情況將相同時點的SGC7901細(xì)胞分為2組感染組：感染LV-ER-α36-RNAi；感染加TeT處理組感染LV-ER-α36-RNAi同時加上2 mg/L TeT處理。在倒置熒光顯微鏡下觀察感染后48 h時熒光表達(dá)情況，評價細(xì)胞感染效率。

2.5 Real-time PCR方法檢測重組質(zhì)粒對ER-α36 mRNA表達(dá)的影響 實驗分為未感染組、陰性對照組(vector-control)和感染組(LV-ER-α36-RNAi組)、感染+不同濃度TeT處理組(感染LV-ER-α36-RNAi后采用0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L和4 mg/L TeT 處理)。SGC7901細(xì)胞分別感染LV-ER-α36-RNAi或GV307-NC 48 h后，收集mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用特異性引物進(jìn)行real-time PCR檢測。ER-α36的上游引物為5’-ACA AGT GGT TTC CTC GTG TCT AA-3’，下游引物為5’-GGG TGT TGA GTG TTG GTT GC-3’；GAPDH的上游引物為5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，下游引物為5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’。Real-time PCR的擴(kuò)增條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)。

2.6 Western blotting法檢測重組質(zhì)粒對ER-α36、Src、ERK、cyclin D1、p416-Src及p527-Src蛋白表達(dá)的影響 檢測ER-α36、Src、ERK、cyclin D1蛋白的表達(dá)，實驗分為未感染組、陰性對照組(vector-control)、感染組(LV-ER-α36-RNAi組)和感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。將上述分組細(xì)胞分別在48 h和72 h后提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE。檢測p416-Src及p527-Src蛋白表達(dá)，實驗分為未感染組和感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。細(xì)胞經(jīng)含2%活性炭吸附的FBS(cFBS)的無酚紅1640處理2 d，再經(jīng)無血清無酚紅1640處理6 h，目的是去除雌激素的影響，再加入終濃度為0 mol/L和1×10-10mol/L 17β雌二醇(17β-estrodial), 5% CO2、37 ℃孵育10 min和20 min，然后分別將上述分組細(xì)胞提取總蛋白。將蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉60 min，抗ER-α36、Src、ERK1/2、cyclin D1、p416-Src及p527-Src蛋白的抗體4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次， 加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min。TBST漂洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測。

2.7 細(xì)胞計數(shù)法檢測雌激素處理下，ER-α36對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 實驗分為未感染組及感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。分別將上述分組細(xì)胞經(jīng)除去雌激素影響處理后，收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，10 cm玻璃平底板每板加入10 000個細(xì)胞。分別加入0 mol/L和1×10-10mol/L 17β-estrodial, 5% CO2、37 ℃孵育5 d和7 d。然后收集細(xì)胞用手持ScepterTM2.0細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析或t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.讓傳播對象感到我們是“命運共同體”。說一些共同關(guān)注的話題，多一點對重大事件和熱點事件的參與，構(gòu)建出彼此尊重、合作雙贏、共同發(fā)展的“命運共同體”，使傳播內(nèi)容更具針對性、親和力和公信力。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒的鑒定

將陽性克隆進(jìn)行PCR實驗并送測序， 測序結(jié)果證實設(shè)計序列正確插入載體且無突變，見圖1。

Figure 1.The sequencing result of LV-ER-α36-RNAi was in accordance with the design planning.

圖1 慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi測序結(jié)果

2 LV-ER-α36-RNAi慢病毒感染

未加TeT處理的感染組的SGC7901細(xì)胞48 h后未出現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記，感染加TeT處理組的SGC7901細(xì)胞48 h后, 熒光顯微鏡觀察顯示細(xì)胞中均表達(dá)紅色熒光蛋白，提示TeT成功誘導(dǎo)紅色熒光蛋白的表達(dá)，重組質(zhì)粒48 h轉(zhuǎn)染效率為80%以上，提示病毒的滴度及轉(zhuǎn)染的效率均比較好，見圖2。

Figure 2.The cell infection rate (48 h after transfection, ×200). A，B: transfected group ；C，D: transfected group with TeT stimulation.

圖2 病毒顆粒感染SGC7901細(xì)胞48 h后紅色熒光蛋白的表達(dá)

3 Real-time PCR方法檢測結(jié)果

相對于未感染組SGC7901細(xì)胞(SGC7901)而言，陰性對照組SGC7901細(xì)胞(vector-control)，ER-α36基因無敲減(P>0.05)；感染組SGC7901細(xì)胞(Low36)，ER-α36基因無敲減(P>0.05)；感染加TeT處理組(Low36+TeT)，0.5、1、2和4 mg/L TeT分別處理48 h，ER-α36基因敲減效率達(dá)到約14.3%、31.3%、65.1%和65.9%; 0.5、1、2和4 mg/L TeT分別處理72 h，ER-α36基因敲減效率達(dá)到約24.6%、34.3%、72.9%和73.1%，見圖3。上述結(jié)果提示，TeT成功誘導(dǎo)Low36細(xì)胞沉默ER-α36 mRNA表達(dá)，具有時間和劑量依賴性，從量效比來看，2 mg/L TeT是最佳誘導(dǎo)濃度。

Figure 3.The mRNA expression of ER-α36 detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsSGC7901.

圖3 Real-time PCR檢測ER-α36 mRNA表達(dá)

4 Western blotting方法檢測結(jié)果

5 細(xì)胞計數(shù)法及Western blotting方法檢測結(jié)果

細(xì)胞計數(shù)法檢測結(jié)果顯示，在濃度為1×10-10mol/L 的17β-estrodial誘導(dǎo)下，沉默ER-α36的SGC7901細(xì)胞(Low36)，cyclin D1表達(dá)降低，增殖能力弱于SGC7901細(xì)胞(P<0.05)。在TeT處理下分別沉默ER-α36 48 h和72 h后，與未沉默組相比，Src、ERK1/2及cyclin D1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖5。相對于SGC7901細(xì)胞而言,低濃度雌激素在10 min未能誘導(dǎo)Low36細(xì)胞Src蛋白416位點磷酸化，在20 min時有微弱的磷酸化，而Src蛋白527位點磷酸化未能明顯降低，說明沉默ER-α36以后，雌激素誘導(dǎo)Src的416位點活化能力降低，見圖6。上述結(jié)果提示，ER-α36與胃癌細(xì)胞增殖能力有關(guān)，Src、ERK1/2及cyclin D1等可能參與ER-α36介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

Figure 4.Inhibitory effects of LV-ER-α36-RNAi on the protein expression of ER-α36. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSGC7901.

圖4 LV-ER-α36-RNAi對ER-α36蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)

Figure 5.The results of cell counting and Western blotting analysis. A: the results of cell counting； B，C: the results of Western blotting analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSGC7901 at 7 d;△P<0.05vsvector-control at 48 h;#P<0.05vsvector-control at 72 h.

圖5 細(xì)胞計數(shù)法及Western blotting法檢測結(jié)果

討 論

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單股正鏈RNA病毒，核心區(qū)域含有編碼核心蛋白(gag)、編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)和編碼包膜蛋白(env)3種重要基因結(jié)構(gòu)，是一種高效感染病毒，可以感染幾乎所有的活細(xì)胞[11]。慢病毒(lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，利用慢病毒載體構(gòu)建的沉默基因表達(dá)載體，其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于物理或化學(xué)方法的轉(zhuǎn)染[12]。TeT調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是基于大腸桿菌四環(huán)素操縱子基礎(chǔ)上建立的可人工調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操控系統(tǒng)[13]。TeT調(diào)控系統(tǒng)包括TeT-on(激活表達(dá))和TeT-off(關(guān)閉表達(dá))2種模式，可以安全有效地調(diào)控外源基因在真核細(xì)胞的表達(dá)水平[14]。

本實驗中構(gòu)建的沉默ER-α36的慢病毒載體選用GV307病毒載體，其載體序列為TetIIP-Turbo-RFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin。慢病毒的基因組所含的CpG島更少，降低宿主的免疫反應(yīng)性，可以更優(yōu)地發(fā)揮其基因沉默的作用，同時又幾乎不引起宿主的免疫反應(yīng)[15,16]。我們的實驗結(jié)果證實，轉(zhuǎn)染了沉默ER-α36的慢病毒載體后，若不給予TeT處理，ER-α36并沒有被敲減，而給予了TeT處理后，ER-α36就被明顯敲減了。因此，含有四環(huán)素調(diào)控位點的GV307病毒載體，不僅攜帶有沉默ER-α36的片段，還帶有控制其表達(dá)的開關(guān)，這是保證實驗研究非常重要的技術(shù)手段。

我們構(gòu)建的沉默ER-α36的慢病毒載體，是深入研究雌激素- ER-α36在胃癌中作用及機(jī)制的前提之一。本項研究的結(jié)果顯示，胃癌SGC7901細(xì)胞被感染的第48 h，轉(zhuǎn)染效率在80%以上，測序結(jié)果顯示，基因設(shè)計序列正確插入載體且無突變。Real-time PCR結(jié)果顯示，ER-α36基因敲減效率達(dá)到約73%。Western blotting結(jié)果顯示，在感染的第48 h和72 h，ER-α36蛋白表達(dá)降低且有統(tǒng)計學(xué)差異。

胃癌是中國常見高發(fā)惡性腫瘤之一，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生具有男性明顯多于女性的特點，而這種性別的差異在女性絕經(jīng)后消失[17]。因此，胃癌的發(fā)生顯然與雌激素有某種關(guān)聯(lián)，但是雌激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)又與ER-α66的關(guān)系不緊密[18]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞和人體胃癌組織樣本中均有ER-α36的表達(dá)，并在胃癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)離胃癌的組織中呈遞減的趨勢，且與患者的年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-9]。

Figure 6.Expression of p416-Src and p527-Src in SGC7901 cells (A) and Low36 cells (B) treated with 1×10-10mol/L 17β-estrodial at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsp416-Src/Src at 0 min;#P<0.05vsp527-Src/Src at 0 min.

圖6 Western blotting法檢測結(jié)果

雌激素通過ER-α36經(jīng)c-Src信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長，在正常情況下, Src-SH2結(jié)構(gòu)域與 C 端 Tyr527 結(jié)合, 后者被蛋白酸氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)磷酸化, 使整個分子呈頭尾卷曲狀態(tài), 將 Src 激酶活性中心遮蓋, 因而 Src 激酶活性處于抑制狀態(tài)。Tyr527 的去磷酸化就可使 Src 活化, Src 激酶一旦解除了抑制狀態(tài), PTK 功能域內(nèi)一個關(guān)鍵酪氨酸殘基就被磷酸化, 其 PTK 活性被激活[3, 19]。Raf/MEK/ERK信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞周期進(jìn)程，是許多上皮性腫瘤增殖的中心調(diào)控環(huán)節(jié)，在許多腫瘤中存在ERK1/2蛋白激活[20-22]。

在本實驗中發(fā)現(xiàn)，在低濃度 17β-estrodial的誘導(dǎo)下，SGC7901細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)，沉默ER-α36后，這種增強(qiáng)效應(yīng)消失(P>0.05)。沉默胃癌細(xì)胞中ER-α36的表達(dá)后， Src、ERK1/2等與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號分子表達(dá)也降低，Src蛋白活化能力降低(P<0.05)。提示可能是通過激活Src激酶及細(xì)胞內(nèi)MAPK(ERK1/2)信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究報道，Src及ERK信號通路可以誘導(dǎo)cyclin D1高表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞增殖[23-24]。

CyclinD1是一種原癌基因，屬于G1細(xì)胞周期蛋白家族，通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6的磷酸化和失活Rb蛋白發(fā)揮作用，是調(diào)控細(xì)胞周期G1向S 期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵蛋白，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時，研究認(rèn)為，cyclin D1與雌激素信號通路相關(guān)[3, 25]。 在胃癌、食管癌、乳腺癌和尿路上皮癌等多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有cyclin D1的過表達(dá)出現(xiàn)[26-27]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，沉默ER-α36后， cyclin D1蛋白表達(dá)降低,提示cyclin D1可能參與ER-α36促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號通路。

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Construction of lentiviral vector-mediated siRNA knockdown ofER-α36 and its action on gastric cancer cell growth

WANG Xu-ming1, 2, HUANG Xuan1, 2, FU Zheng-qi1, 2, ZOU Feng1, ZHANG Shang-kun1, WANG Zhao-yi1, LIU Li-jiang1, 2

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofMedicine，2DepartmentofHistopathology,JiangdaPathologyInstitute,JianghanUniversity,Wuhan430056,China.E-mail:liulijiang@163.com)

AIM: To construct a lentiviral vector for stable delivery of theER-α36 gene and to detect its effect on SGC7901 cell growth. METHODS: The efficient RNAi targeting sequences identified for theER-α36 gene were screened. The Oligo DNA was synthesized with target sequences and annealed to form double-stranded DNA. Then it was digested byXhoI andEcoR I and connected with GV307 vector to produce LV-ER-α36-RNAi lentiviral vector. PCR was used to screen the positive clones and sequence. The LV-ER-α36-RNAi, pHelper 1.0 and pHelper 2.0 plasmids were co-transfected into 293T cells for producing lentiviral vector and infecting SGC7901 cell line. Fluorescence microscopy, real-time PCR and Western blotting were used to detect the transfection efficiency and gene silencing effect. 17β-estrodial at concentration of 1×10-10mol/L was used to stimulate the recombinant cell line, and the action on the growth of gastric cancer cells and the expression of Src, ERK1/2 and cyclin D1 were determined. RESULTS: DNA sequencing analysis confirmed the identity of recombinant shRNA expression vectors. Immunofluorescence assay demonstrated that transfection efficiency was above 80%. Transfection of LV-ER-α36-RNAi significantly knocked down the expression of ER-α36 at mRNA and protein levels with tetracycline (TeT) simulating as revealed by real-time PCR and Western blotting. Compared with control group, the growth of the recombinant cell line declined and the expression of Src, ERK1/2 and cyclin D1 and the activation of Src decreased (P<0.05).CONCLUSION: Lentiviral vectors that silenceER-α36 expression are constructed successfully and can be used to study the role of ER-α36 in gastric cancer. TheER-α36 is related with many kinds of cancer cell growth, including gastric cancer cells.

SGC7901 cells; Estrogen receptorα 36; Lentivirus vector

1000- 4718(2014)12- 2113- 07

2014- 06- 25

2014- 07- 28

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30870981; No. 812727754)

R393； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.001

△通訊作者 Tel： 027-84226503； E-mail: liulijiang@163.com