應(yīng)用PCR方法對(duì)三種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鉤端螺旋體感染情況的調(diào)查研究

馮育芳, 邢 進(jìn), 鞏 薇，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

研究報(bào)告

應(yīng)用PCR方法對(duì)三種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鉤端螺旋體感染情況的調(diào)查研究

馮育芳, 邢 進(jìn), 鞏 薇，岳秉飛，賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

目的 建立有效的鉤端螺旋體PCR檢測(cè)方法，并對(duì)樹鼩((tree shrew,Tupaiabelangeri))、長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus; Mongolian gerbil)和灰倉鼠(Cricetulusmigratorius)等三種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行感染情況調(diào)查。方法 針對(duì)NCBI公布的鉤端螺旋體序列，設(shè)計(jì)并篩選特異性引物，優(yōu)化PCR體系，進(jìn)行特異性和敏感性測(cè)試；并運(yùn)用優(yōu)化PCR方法對(duì)樹鼩、長(zhǎng)爪沙鼠和灰倉鼠樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 成功建立鉤端螺旋體PCR檢測(cè)方法，序列測(cè)定驗(yàn)證了該方法的特異性。普通級(jí)樹鼩鉤端螺旋體的陽性率為8.33%，普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠鉤端螺旋體為100%，清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠和清潔級(jí)灰倉鼠鉤端螺旋體的陽性率為0%。結(jié)論 本研究建立了鉤端螺旋體PCR檢測(cè)方法，調(diào)查了樹鼩、長(zhǎng)爪沙鼠和灰倉鼠三種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染情況，為這三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究和使用奠定基礎(chǔ)。

樹鼩；長(zhǎng)爪沙鼠；灰倉鼠；鉤端螺旋體；PCR

鉤端螺旋體病(Leptospirosis，簡(jiǎn)稱鉤體病) 是由鉤端螺旋體(Leptospiraspp，簡(jiǎn)稱鉤體)引起的一種人獸共患的自然疫源性傳染病[1]。該病的早期癥狀包括高燒、流口水、眼睛紅腫及“茶色”尿液，如病菌入侵腎臟、肺和心臟可危及生命。我國(guó)鉤端螺旋體病疫區(qū)分布廣泛，主要分布在北緯25°～35°，東經(jīng)100°～129°之間，也是長(zhǎng)江流域的一些省份[2]。這些區(qū)域的鼠類或其他嚙齒動(dòng)物是鉤體重要的傳染源[1]。

近年來，伴隨著醫(yī)學(xué)研究的需要，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家族逐步壯大；其中樹鼩、長(zhǎng)爪沙鼠和灰倉鼠基于其自身的生理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成為生物醫(yī)學(xué)研究中的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。參照我國(guó)鉤體病的地理分布情況[2]，發(fā)現(xiàn)這三種動(dòng)物的來源地均處于鉤體疫區(qū)，因此，對(duì)樹鼩、長(zhǎng)爪沙鼠和灰倉鼠等新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行鉤體感染情況調(diào)查非常必要。鉤體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常規(guī)使用血清學(xué)和分離培養(yǎng)方法，但是由于血清學(xué)方法需要的抗原較難獲得，且建立穩(wěn)定的血清學(xué)方法耗時(shí)較長(zhǎng)。同時(shí)，鉤體培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)要求較高，靈敏度較低，培養(yǎng)法很難達(dá)到理想的結(jié)果。因此，本文運(yùn)用PCR方法對(duì)這三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的鉤端螺旋體感染情況進(jìn)行調(diào)查，有效縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度，可有效保證實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的安全。

1 材料和方法

1.1 菌株

陽性菌株犬鉤端螺旋體和爪哇群56660來源于本院，均為我國(guó)主要流行的鉤端螺旋體菌株。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)和鉤端螺旋體序列，在鉤體保守基因secY區(qū)域共獲得2對(duì)引物，詳細(xì)信息見表1；Oligo 6軟件驗(yàn)證可用，并委托Takara公司合成。

1.3 鉤端螺旋體DNA提取

陽性鉤體純培養(yǎng)后直接提取DNA，DNA提取使用Qiagen的Dneasy Blood & Tissue Kit (Cat. No.69504)，詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.4 PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10× buffer 2 μL, dNTP 1.6 μL, DEPC水 11.4 μL，引物各1 μL，Hs Taq酶1 μL，DNA 2 μL。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，并送Takara公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 特異性測(cè)定

將該P(yáng)CR擴(kuò)增序列以及雙向引物與GenBank上的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定是否為特異性片段，陽性樣本均送測(cè)序，并進(jìn)行比對(duì)。

1.6 敏感性測(cè)定

陽性菌株純培養(yǎng)后，按上述方法直接提取DNA，將提取的DNA倍比稀釋為20 μg/mL、2 μg/mL、2.0×10-1μg/mL、2.0×10-2μg/mL、2.0×10-3μg/mL、2.0×10-4μg/mL、2.0×10-5μg/mL、2.0×10-6μg/mL、2.0×10-7μg/mL、2.0×10-8μg/mL、2.0×10-9μg/mL、2.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法進(jìn)行測(cè)定，以確定其檢測(cè)閾值。

1.7 樣本來源及采集

全血樣品共計(jì)224份，其中普通級(jí)樹鼩全血樣品60份(A單位)；長(zhǎng)爪沙鼠全血樣品104份，其中清潔級(jí)樣品82份(B單位)，普通級(jí)樣品22份(C單位)；清潔級(jí)灰倉鼠全血樣品60份(D單位)。動(dòng)物全血無菌采集，EDTA抗凝，吸取300 μL用于提取DNA，全血DNA提取方法如上。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)體系建立

為測(cè)試引物擴(kuò)增效果及優(yōu)化反應(yīng)條件，以犬鉤端螺旋體和爪哇群56660為陽性對(duì)照模板，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)鉤端螺旋體檢測(cè)的引物進(jìn)行篩選，結(jié)果Lep 12引物擴(kuò)增結(jié)果較好，條帶清晰，無雜帶，與目的片段長(zhǎng)短相符，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為鉤端螺旋體序列(圖1)。最后確定Lep 12引物為本實(shí)驗(yàn)較為合適的檢測(cè)引物。

通過溫度梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后確定最適反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min(圖2)。

表1 引物名稱、序列及擴(kuò)增片段Tab.1 The names, sequences and amplification fragments of the primers

圖2 不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of the PCR amplification at different annealing temperatures

圖3 敏感性試驗(yàn)Fig.3 The results of sensibility test

圖4 普通級(jí)樹鼩樣本鉤端螺旋體檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of PCR assay of 60 samples from conventional tree shrews

圖5 清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠樣本鉤端螺旋體檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of the PCR assay of 82 samples from clean Mongolian gerbils

為測(cè)定該P(yáng)CR方法的敏感性，選取爪哇群56 660 DNA提取物，使用PCR水做10個(gè)稀釋度，1～10為10倍系列稀釋結(jié)果，從圖3可見本實(shí)驗(yàn)方法最高可檢測(cè)2.0×10-4μg/mL，靈敏度較好。

2.2 普通級(jí)樹鼩鉤體感染情況調(diào)查

60份普通級(jí)樹鼩血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增特異性片段，以檢測(cè)是否存在鉤體的感染。在這些樣品中，共檢出5個(gè)陽性標(biāo)本(圖4)。

2.3 清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠鉤體感染情況調(diào)查

從B單位獲取的82份清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增特異性片段，以檢測(cè)是否存在鉤體的感染。在這些樣品中，均未檢出陽性標(biāo)本(圖5)。

從C單位獲取的22份普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增特異性片段。這些樣品均為陽性標(biāo)本，顯示的條帶深淺存在差異(圖6)。由于普通級(jí)群體的感染情況較為復(fù)雜，因此，出現(xiàn)了雜帶，但產(chǎn)物大小與目標(biāo)序列一致，而且序列測(cè)定結(jié)果無誤。

圖6 普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠樣本鉤端螺旋體檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Results of the PCR assay of 22 samples from conventional Mongolian gerbils

2.4 清潔級(jí)灰倉鼠鉤體感染情況調(diào)查

從D單位獲得的60份清潔級(jí)灰倉鼠血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增特異性片段，電泳結(jié)果顯示，這60份樣品中沒有陽性標(biāo)本(圖7)。

圖7 清潔級(jí)灰倉鼠樣本鉤端螺旋體檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of the PCR assay of 60 samples from clean gray hamsters

3 討論

鉤體病是人獸共患病，患此病的動(dòng)物主要是嚙齒類動(dòng)物以及豬、犬和牛等家畜。小鼠感染鉤體后發(fā)病輕微呈慢性帶菌狀態(tài)，而豚鼠作為鉤體感染敏感動(dòng)物表現(xiàn)為急性發(fā)病且可死亡。說明該病原能影響動(dòng)物健康狀況。而且，由于鉤體能感染人類，早期癥狀包括高燒、流口水、眼睛紅腫及“茶色”尿液，如病菌入侵腎臟、肺和心臟可危及生命。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物該病原的調(diào)查和排除是非常重要和必要的。

樹鼩，樹鼩科樹鼩屬的動(dòng)物，其許多分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似于人類，且對(duì)多種人類重要病原易感，可作為重要人類病原的動(dòng)物模型[3]；同時(shí)其在腫瘤學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)、免疫學(xué)等方面的作用也得到科研人員的肯定，因此，樹鼩作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源正越來越受到重視[4,5]。由于樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化時(shí)間較短，而且微生物凈化難度較高，現(xiàn)有樹鼩還是普通級(jí)；此外，本研究所檢樹鼩來源于鉤端螺旋體病高發(fā)的西南亞區(qū)[2]，因此，樹鼩存在鉤端螺旋體的陽性動(dòng)物較為正常，感染率為8.33%。

長(zhǎng)爪沙鼠又稱蒙古沙鼠，分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬，由于其在多個(gè)方面獨(dú)特的生物學(xué)特性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、行為學(xué)等多個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域，是一種正在開發(fā)、有著廣闊前景的多功能的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6, 7]。由于野生或普通長(zhǎng)爪沙鼠存在多種嚴(yán)重病原，長(zhǎng)期以來，為了提高長(zhǎng)爪沙鼠種群的微生物與寄生蟲質(zhì)量控制水平，研究人員一直在篩選適合長(zhǎng)爪沙鼠種群凈化的代乳鼠，試圖建立穩(wěn)定的質(zhì)量控制技術(shù)體系[8]。喬欣等人通過長(zhǎng)期的技術(shù)服務(wù)實(shí)踐，以ICR 小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠剖腹產(chǎn)代乳鼠進(jìn)行種群凈化的應(yīng)用研究取得了進(jìn)展。代乳成活率超過50%，微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)檢測(cè)均符合小鼠相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。代乳鼠與非代乳鼠其生長(zhǎng)曲線沒有差異[9]。因此，長(zhǎng)爪沙鼠不同種群鉤端螺旋體感染率存在顯著差異。也從側(cè)面說明長(zhǎng)爪沙鼠微生物凈化較為成功。

灰倉鼠在自然界參與土拉倫、森林腦炎、鼠疫等多種自然疫源性疾病傳播[10]，并且對(duì)仙臺(tái)病毒易感。而且，灰倉鼠已被用作鼠疫、包蟲病、利氏曼病、腫瘤研究的理想的動(dòng)物模型。我國(guó)現(xiàn)在已進(jìn)行灰倉鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化和生物凈化[11]，因此，清潔級(jí)灰倉鼠的鉤端螺旋體感染率較低，也說明該種群微生物凈化效果較好。

本研究建立了鉤端螺旋體PCR檢測(cè)方法，調(diào)查了樹鼩、長(zhǎng)爪沙鼠和灰倉鼠三種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染情況，為這三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究和使用奠定了基礎(chǔ)。

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Investigation ofLeptospirainfection in three new experimental animals by PCR methods

FENG Yu-fang, XING Jin, GONG Wei, YUE Bing-fei, HE Zheng-ming

(Institute for Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To establish an effective PCR assay for leptospirosis detection, and applicate the assay in tree shrew, mongolian gerbil and gray hamster. Methods Sequence of leptospira was obtained from the NCBI Genbank, and primers were designed based on the sequences. The positive amplified fragments were sequenced to verify the reliability of the method. The samples from tree shrew, mongolian gerbils and hamsters were tested using this PCR method. Results The PCR method for detection of leptospirosis was successfully established. The positive rate ofLeptospirawas 8.33% in 60 samples of conventional tree shrews, 100% in 104 samples of the conventional Mongolian gerbils, and 0% in 60 samples of clean gray hamsters. Conclusions The establishment of this PCR assay is useful in the detection of leptospirosis in tree shrew, mongolian gerbil and gray hamster. The results of our investigation of leptospira infection levels of the three new experimental animals may promote their application in biomedical research.

Tree shrew; Mongolian gerbil; gray hamster; leptospirosis; PCR

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究(2013BAK11B01)。

馮育芳(1981-)，女，助理研究員，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)，E-mail: fyf307@126.com。

賀爭(zhēng)鳴 (1957-)，男，博士，研究員，研究方向：微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: zhengminghe57@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0031-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.008

2014-06-05