實驗用斑馬魚養(yǎng)殖地方標(biāo)準(zhǔn)的初步探討

柯賢福，胡慧穎，吳立仁，施張奎

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實驗動物管理辦公室，杭州 310013)

經(jīng)驗交流

實驗用斑馬魚養(yǎng)殖地方標(biāo)準(zhǔn)的初步探討

柯賢福，胡慧穎，吳立仁，施張奎

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實驗動物管理辦公室，杭州 310013)

斑馬魚因其特有的優(yōu)勢，正越來越廣泛的運用于藥物篩選、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，但斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化問題一直未能很好的解決，目前既無國家標(biāo)準(zhǔn)，也沒有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，一定程度上局限了斑馬魚作為實驗用魚的廣泛應(yīng)用，也不利于管理部門頒發(fā)實驗用斑馬魚的行政許可證書。在此背景下，本文從斑馬魚的環(huán)境與設(shè)施、養(yǎng)殖用水、飼料等方面的標(biāo)準(zhǔn)化問題進(jìn)行初步探討，以期促進(jìn)實驗用斑馬魚的浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)的形成。

地方標(biāo)準(zhǔn)；斑馬魚，飼養(yǎng)

斑馬魚(zebrafish，Daniorerio)是國際上在科學(xué)研究實驗中使用最廣泛的魚類模式生物，具有體積小(可用微孔板分析)、發(fā)育周期短、體外受精、透明(可直接用肉眼和解剖顯微鏡觀察)、單次產(chǎn)卵數(shù)較高以及實驗用藥量小，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動物高度相似等優(yōu)點。近期研究結(jié)果表明斑馬魚與人類基因同源性高達(dá)85%以上，其信號傳導(dǎo)通路與人類基本近似。斑馬魚的應(yīng)用日益廣泛，我省也有大量的單位開展與斑馬魚相關(guān)的研究工作，而與之相反的是其標(biāo)準(zhǔn)化程度一直不高，一定程度上阻礙了其作為模式生物的應(yīng)用。本文在簡要回顧斑馬魚的主要應(yīng)用的基礎(chǔ)上，就斑馬魚的環(huán)境設(shè)施、養(yǎng)殖用水及飼料標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，以期建立實驗用斑馬魚的浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)。

1 實驗用斑馬魚的應(yīng)用

從1960年開始，斑馬魚就被用于科學(xué)研究，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)與遺傳學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域。近年來，斑馬魚在發(fā)育生物學(xué)研究、癌癥研究、神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)研究以及藥物研發(fā)等領(lǐng)域中也得到了廣泛應(yīng)用，美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)于2003年將斑馬魚列為繼大鼠、小鼠之后的第三重要的實驗動物。

斑馬魚不僅在基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，在應(yīng)用研究領(lǐng)域的使用也越來越普遍。歐洲早在1915年就開始利用斑馬魚進(jìn)行環(huán)境評估測試的實驗，現(xiàn)在歐洲各主要環(huán)保機(jī)構(gòu)都以技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的形式承認(rèn)利用斑馬魚進(jìn)行環(huán)境評估和化合物毒性評價的結(jié)果。美國環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency, EPA)已于2008年正式接受并認(rèn)可用斑馬魚進(jìn)行環(huán)境評估和化合物毒性評價結(jié)果。在我國，斑馬魚也已成為環(huán)境毒理學(xué)分析和化合物毒性評價的一個重要模式生物，有7個化學(xué)品毒性和水質(zhì)安全檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)都將斑馬魚列為了推薦使用動物。目前，斑馬魚已經(jīng)被廣泛用于評價化合物的發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、心血管毒性、基因毒性、生殖毒性、致畸性和組織器官毒性等一系列毒性，也是環(huán)境毒性分析領(lǐng)域的一個重要模式動物。

斑馬魚在藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。自從二十世紀(jì)90年代進(jìn)入新藥研發(fā)領(lǐng)域以來，現(xiàn)已在歐美國家廣泛應(yīng)用于新藥篩選、藥物毒性與安全性評價。使用斑馬魚模型可以評價藥物的發(fā)育毒性、心血管毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和基因基因毒性等，也可以使用斑馬魚模型篩選癌癥、細(xì)菌感染、神經(jīng)退行性疾病、肥胖病和傳染性疾病等疾病的治療藥物。2009年歐洲的一家斑馬魚藥物篩選技術(shù)服務(wù)公司Biobide獲得了美國食品與藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMEA)的GLP認(rèn)證，標(biāo)志著斑馬魚藥物篩選與藥物安全性評價技術(shù)已得到歐美國家政府的正式認(rèn)可。

斑馬魚作為一種模式生物代表了新藥篩選和環(huán)境毒理評價發(fā)展的方向，國際國內(nèi)市場前景巨大。近年來，斑馬魚在我省生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，然而，斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化問題日益凸顯，亟待解決。

2 實驗用斑馬魚的環(huán)境與設(shè)施

2.1 環(huán)境條件

斑馬魚養(yǎng)殖環(huán)境分為水體環(huán)境和外部環(huán)境。水體環(huán)境指斑馬魚養(yǎng)殖水體，外部環(huán)境指斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)所處的室內(nèi)環(huán)境。斑馬魚養(yǎng)殖的外部環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)參照國標(biāo)《實驗動物 環(huán)境及設(shè)施 GB14925-2010》對于哺乳類實驗動物普通環(huán)境級別的要求制定，具體技術(shù)指標(biāo)見表1。因斑馬魚的生活環(huán)境為水體，故外部環(huán)境的濕度不參考GB14925，且斑馬魚生活環(huán)境的晝夜明暗交替時間宜為14 h(明)/10 h(暗)。斑馬魚養(yǎng)殖的外部環(huán)境指標(biāo)應(yīng)符合表1所列要求。

表1 斑馬魚養(yǎng)殖設(shè)施外部環(huán)境指標(biāo)Tab.1 The external environment indexes of laboratory zebrafish

2.2 區(qū)域布局

斑馬魚養(yǎng)殖區(qū)域包括飼養(yǎng)繁育區(qū)和輔助區(qū)域及設(shè)備。其中斑馬魚飼養(yǎng)繁殖區(qū)包括魚過渡室、魚養(yǎng)殖室、清潔物品貯藏室等；輔助區(qū)域主要包括水處理室、倉庫、洗刷間、廢棄物品存放處理間、機(jī)械設(shè)備室、準(zhǔn)備室、工作人員休息室；設(shè)備包括水處理系統(tǒng)、斑馬魚孵化箱、斑馬魚尸體冷藏設(shè)備等。

2.3 養(yǎng)殖設(shè)備

2.3.1 凈水供水設(shè)備：凈水供水設(shè)備用于制備凈水和向斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中補(bǔ)充凈水。凈水供水設(shè)備由自來水水桶、水處理單元、凈水循環(huán)泵、凈水水桶和自動控制系統(tǒng)組成。自來水經(jīng)水處理單元處理后制成反滲透水并收集至凈水水桶中，自動控制系統(tǒng)根據(jù)凈水水桶液位控制凈水制備過程。凈水水桶中的凈水由自動控制系統(tǒng)控制，自動向養(yǎng)殖系統(tǒng)補(bǔ)水。

2.3.2 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)由養(yǎng)殖單元組和水體循環(huán)單元組成。養(yǎng)殖單元組由多個養(yǎng)殖單元排列，每個養(yǎng)殖單元分層安裝養(yǎng)殖缸，有供水及排水設(shè)計；養(yǎng)殖單元框架應(yīng)使用不銹鋼制作并焊接牢固。水體循環(huán)單元由水體循環(huán)泵、微濾、炭濾、紫外線消毒器、電導(dǎo)率調(diào)整、pH調(diào)整、控制箱組成，用于養(yǎng)殖系統(tǒng)水的循環(huán)凈化。送排水管道應(yīng)采用無毒、無脫落、不含可塑劑的聚氯乙烯材料，能夠拆卸、清洗。

2.3.3 其他養(yǎng)殖設(shè)備：養(yǎng)殖缸：食品級聚甲基戊烯材質(zhì)，可耐受高壓蒸汽滅菌，配有可移動式隔板及上蓋。水體采取溢流式循環(huán)，可自動清除沉淀殘渣。

交配盒：食品級聚甲基戊烯材質(zhì)，可耐受高壓蒸汽滅菌。

魚網(wǎng)：食品級、不含可塑劑的聚氯乙烯，無脫落，表面光滑。

豐年蝦孵化器：宜為亞克力材質(zhì)，應(yīng)為食品級。

2.3.4 斑馬魚養(yǎng)殖密度：斑馬魚養(yǎng)殖應(yīng)保持合適的密度，密度過低，不利于養(yǎng)殖體系的有效利用；密度過高，則會導(dǎo)致不同斑馬魚個體之間因采食競爭激烈，而使個體差異較大，且會引起養(yǎng)殖水體代謝產(chǎn)物濃度過高，最終影響斑馬魚的正常生長發(fā)育。此類研究在巨英超、王天奇等學(xué)者的報道中均有所體現(xiàn)[1-5]。建議實驗用斑馬魚養(yǎng)殖密度如表2所示。

表2 實驗用斑馬魚的養(yǎng)殖密度Tab.2 Breeding density of laboratory zebrafish

3 實驗用斑馬魚的養(yǎng)殖水體

養(yǎng)殖水體是斑馬魚直接接觸與生活的環(huán)境，故養(yǎng)殖水體的標(biāo)準(zhǔn)化是實驗用斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)化的重要組成部分。

3.1 水溫

合適的溫度有利于斑馬魚的正常生長，且能提高食物利用率，增加抗病能力。實驗用斑馬魚的適宜水溫為(26～28.5)℃。

3.2 pH值

斑馬魚在pH值低于5.5的酸性水環(huán)境中生活，易感染魚類傳染病，不利于其正常生存。實驗用斑馬魚的養(yǎng)殖水體pH值應(yīng)控制在6.8～7.8。

3.3 氨氮(NH3/NH4+)

氨氮是反映水質(zhì)情況的重要指標(biāo)，氨對魚類具有較強(qiáng)的毒性，斑馬魚的養(yǎng)殖水體總氨應(yīng)不大于0.02 mg/L。

3.4 余氯

魚類對氯非常敏感，氯不僅損害魚腮，而且可以殺死生物過濾器中的硝化細(xì)菌，引起氨和亞硝酸鹽升高，易引起魚類較短時間內(nèi)死亡。市政用水因為消毒的需要，通常會含氯成分，故斑馬魚的養(yǎng)殖用水需除去其中的余氯。實驗用斑馬魚的養(yǎng)殖水體余氯需不大于0.2 mg/L。

3.5 溶解氧

魚類生活于水中，用腮進(jìn)行氣體交換，養(yǎng)殖水體中溶解氧含量的多少直接影響斑馬魚的新陳代謝。實驗用斑馬魚養(yǎng)殖水體的適宜溶解氧含量為6～14 mg/L。

3.6 換水率

既要保證斑馬魚生存的正常環(huán)境不被破壞，又要確保水體質(zhì)量符合微生物等指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，故需要維持一定的換水率。斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的水體每天需更新總水量的5%～10%。

3.7 電導(dǎo)率

養(yǎng)殖水體的電導(dǎo)率高低跟其內(nèi)含溶質(zhì)鹽的濃度或其它會分解為電解質(zhì)的化學(xué)雜質(zhì)有關(guān)，是測量水的含鹽成分、含離子成分、含雜質(zhì)成分等等的重要指標(biāo)。造成電導(dǎo)率的主要離子包括Cl-、Na+、SO42-、Ca2+、K+等，魚類對鹽分有一定的需求，斑馬魚養(yǎng)殖水體的電導(dǎo)率以450～550 μS為宜。

實驗用斑馬魚養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)要求如表3所示。所列數(shù)值需在26℃～28.5℃水溫下測得。

表3 實驗用斑馬魚養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)要求Tab.3 Water quality requirements of laboratory zebrafish

4 實驗用斑馬魚的飼料

4.1 配合飼料質(zhì)量要求總原則

4.1.1 在配制實驗動物配合飼料時，各種原料和添加劑的各項營養(yǎng)指標(biāo)應(yīng)采用實測值數(shù)據(jù)。

4.1.2 營養(yǎng)指標(biāo)均以90%干物質(zhì)為基礎(chǔ)，衛(wèi)生指標(biāo)以88%干物質(zhì)為基礎(chǔ)。

4.1.3 各項氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及微量元素的指標(biāo)均為配合飼料中的總含量。

4.1.4 感官指標(biāo) 配合飼料應(yīng)混合均勻，新鮮、無雜質(zhì)、無異味、無霉變、無發(fā)酵、無蟲蛀及鼠咬。

4.1.5 配合飼料不得摻入抗生素、驅(qū)蟲劑、促生長劑以及激素等藥物及添加劑。

4.2 配合飼料營養(yǎng)成分指標(biāo)

斑馬魚所用配合飼料的成份包括：魚制品，麥殼類，酵母，植物蛋白萃取，軟體，甲殼類，脂質(zhì)，藻類，糖類，卵磷脂，EEC 核準(zhǔn)色素。

各營養(yǎng)成份組成：蛋白質(zhì)：48%，脂肪：8%，纖維：2%，灰質(zhì)：11%，水分：6%

維生素(每kg)：VA：37600國際單位，VD3：2000國際單位，VE：125毫克，VC：265毫克。

4.3 活性餌料

4.3.1 豐年蝦是斑馬魚養(yǎng)殖的重要活性餌料，豐年蝦生存在一定鹽度的海水或湖水中，國內(nèi)的豐年蝦卵按來源可以分為渤海灣鹽田卵、艾比湖蟲卵、西藏卵、尕海卵。

4.3.2 保存溫度0℃-5℃、干燥避光。

4.3.3 打開包裝罐的產(chǎn)品不宜長期使用。

4.3.4 不得與有毒物質(zhì)同時存放。

4.3.5 豐年蝦的孵化：向反滲透水中加入人工海鹽和碳酸氫鈉，海鹽濃度為15 g/L、碳酸氫鈉濃度為2 g/L；每升水加入3 g豐年蝦卵；在28℃、持續(xù)光照條件下曝氣孵化24-34 h。孵化結(jié)束后，收集已孵化的幼蝦，清除未孵化的死卵。

4.3.6 豐年蝦的喂食量：孵化后的豐年蝦用反滲透水清洗干凈后使之懸浮于同樣的水中，幼蝦與水的體積比為1∶9。喂食時每條成魚喂0.5 mL即可。

4.3.7 豐年蝦的微生物控制。因豐年蝦是斑馬魚的活性餌料，直接存在于斑馬魚的養(yǎng)殖水體，故需對其所攜帶的微生物進(jìn)行監(jiān)測。豐年蝦卵來自海洋或鹽湖，采集后經(jīng)清洗并在-20℃凍存6個月后方可使用，自身攜帶微生物有限，但需要排除易引起斑馬魚疾病的遲緩愛德華氏菌、分枝桿菌等病原微生物，具體指標(biāo)及檢測方法它文另述。

5 結(jié)語

實驗用斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化研究，是一項復(fù)雜的系統(tǒng)性工作，涉及到斑馬魚的環(huán)境設(shè)施與設(shè)備、養(yǎng)殖水體、飼料、微生物控制、疾病控制等方面，本文僅從其環(huán)境及設(shè)施、養(yǎng)殖水體、飼料等方面進(jìn)行初步探討，還需在后續(xù)工作中進(jìn)一步深入研究。此外，魚類實驗動物的實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化研究的更為核心的工作在于魚類疾病的控制和健康狀況的維持[6]，吳思奡[7]、祝梅香[8]、孫德明等[9]已從實驗用斑馬魚的微生物寄生蟲控制、疾病控制、營養(yǎng)需求等方面開展了相關(guān)研究，但真正實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，尚有大量的工作需要開展。

[1] 巨英超, 謝英, 劉超, 等. 不同飼養(yǎng)密度對斑馬魚生長發(fā)育的影響 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(3):31-33.

[2] 王天奇, 孫榮澤, 孫德明. 實驗用魚類的水環(huán)境及其標(biāo)準(zhǔn)化 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(12):44-51.

[3] 顧新國. 斑馬魚的飼養(yǎng)與繁殖 [J]. 河北漁業(yè), 2007, (12) :30-31.

[4] 陳春娜, 黃穎穎, 陳先均. 養(yǎng)殖密度對長薄鰍稚魚生長的影響[J]. 當(dāng)代水產(chǎn),2011,(6):65-68.

[5] 陳曉倩,殷浩文.斑馬魚飼養(yǎng)循環(huán)裝置中的水生環(huán)境微生物群落代謝 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 17(2):110-114.

[6] 熊靜, 關(guān)瑞章, 王藝?yán)? 等. 魚類實驗動物研究概況及標(biāo)準(zhǔn)化研究過程面臨的主要問題 [J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué), 2012, 32(4):366-370.

[7] 吳思奡, 王箐, 高昌,等.實驗用斑馬魚主要疾病及其實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化研究過程面臨的主要問題 [J]. 實驗動物科學(xué), 2009, 26(4):51-56.

[8] 祝梅香, 王天奇, 張長勇, 等.實驗用斑馬魚劍尾魚營養(yǎng)需求及飼料現(xiàn)狀分析 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(12):61-65.

[9] 孫德明, 穆苑, 高昌, 等. 模型動物斑馬魚及其特定病原凈化 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(12):52-60.

更 正

《中國比較醫(yī)學(xué)雜志》2014年24卷第6期第16頁文章《雌激素對小鼠心室肌細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道活性的影響》一文，作者樸伶華的單位“海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院”更正為“海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部”，通訊作者柳賢德的單位“海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部”更正為“海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院”，特此更正。

Preliminary study on Zhejiang provincial standard of laboratory zebrafish breeding

KE Xian-fu, HU Hui-ying , WU Li-ren , SHI Zhang-kui

(Zhejiang Administration Office of Laboratory Animal, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)

Because of its unique advantages, zebrafish has been more and more widely used in drug screening and safety assessment, environmental protection, developmental biology and other fields. But the standardization of environments, feed, and water environment of zebrafish are prominent problems and weakness which hindered their application. This paper probes into the standardization of environment and feed of zebrafish in Zhejiang, in order to promote its standardization construction.

Provincial standardization; Laboratory zebrafish; Breeding

浙江省科技計劃項目(2012C37095，2014F30020)。

柯賢福(1980-)，男，助理研究員，研究方向：實驗動物管理，E-mail: kexfke@163.com。

吳立仁(1964-)，男，副研究員，研究方向：實驗動物管理，E-mail: zjsdgb@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0075-04

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.017

2014-06-06