2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用

劉艷冬， 宋飛玉，馬曉明， 王 琳，毛 磊， 洪 迪， 宋祥福

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021；2.吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，吉林 132013)

研究報(bào)告

2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用

劉艷冬1， 宋飛玉2，馬曉明1， 王 琳1，毛 磊1， 洪 迪1， 宋祥福1

(1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021；2.吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，吉林 132013)

目的 研究2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用。 方法 將48只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為4組，即對照組(玉米油)和低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)2,4-滴丁酯染毒組，每組12只。采用灌胃方式進(jìn)行染毒，每天1次，每周連續(xù)染毒6 d，實(shí)驗(yàn)周期為5周。染毒結(jié)束后采用分光光度法對睪丸組織中總抗氧化能力(T-AOC)、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+K+-ATPase及Ca++Mg++-ATPase的活性進(jìn)行測定。結(jié)果 T-AOC活力隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高逐漸下降，高劑量組與其他組比較差異顯著；與對照組和低劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，高、中劑量組睪丸組織中LDH活力值較低，差異顯著，且高劑量組與中劑量組比較差異顯著；SDH活力隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，高、中劑量組與對照組相比較差異顯著，且高劑量組與中、低劑量組比較差異顯著；與對照組和低劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，高、中劑量組睪丸組織中Na+K+-ATPase活力值較低，且差異顯著；實(shí)驗(yàn)組Ca++Mg++-ATPase活力與對照組比較差異顯著。結(jié)論 2,4-滴丁酯染毒對雄性小鼠睪丸組織具有一定的毒性作用。

2,4-滴丁酯；睪丸；SDH；LDH；ATPase；T-AOC；生殖毒性

2.4-D丁酯為苯氧乙酸類激素型選擇性除草劑，其性質(zhì)為無色油狀液體，難溶于水，易溶于多種有機(jī)溶劑，是世界上使用最廣泛的除草劑之一。2,4-滴丁酯屬于低毒性除草劑，急性中毒少見[1]。但是2,4-滴丁酯揮發(fā)性強(qiáng)、分布范圍廣，常因使用不恰當(dāng)而對環(huán)境造成污染，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重的危害[2,3]，因而其毒性和殘留問題日益受到人們的重視。國內(nèi)外曾報(bào)道過2,4-滴丁酯中毒的病例，臨床癥狀早期主要表現(xiàn)為：頭暈、無力、惡心、嘔吐、煩躁等，隨著病情的發(fā)展可出現(xiàn)多臟器的損害[4]。目前關(guān)于2，4-滴丁酯的生殖毒性及其作用機(jī)制研究較少。本研究旨在從能量代謝及抗氧化能力的角度出發(fā)，探討2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性清潔級ICR小鼠48只，體質(zhì)量(25±2)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號為【SCXK(吉)2007-0003】。

1.2 主要試劑與儀器

2,4-滴丁酯(上海至鑫化工有限公司)；總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)測試盒、三磷酸腺苷(ATP)酶測試盒、總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)。

恒溫水浴箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；722型分光光度計(jì)(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

1.3 動(dòng)物分組及染毒方法

將48只雄性清潔級ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即對照組(玉米油)和低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)2,4-滴丁酯染毒組。采用灌胃方式進(jìn)行染毒，實(shí)驗(yàn)組均給予0.27 mL 2,4-滴丁酯染毒溶液，對照組給予等量的玉米油，每天1次，每周連續(xù)染毒6 d，共5周。每周末稱量并記錄小鼠體重，根據(jù)體重確定下周的染毒劑量。

1.4 樣本的采集與制備

于末次染毒結(jié)束后24 h，處死小鼠，取出雙側(cè)睪丸，再稱取適量睪丸組織，在冰水浴條件下，加生理鹽水研磨后，制備成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心15 min，取上清液待測。

1.5 樣本的測定

將制備好的待測上清液嚴(yán)格按照T-AOC、LDH、SDH、Na+K+-ATPase、Ca++Mg++-ATPase測試盒說明書檢測樣品的吸光度，根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算出相應(yīng)酶的活力。組織中的蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部測定數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸組織中T-AOC活力的測定結(jié)果

T-AOC活力隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高逐漸下降，高劑量組與其他組比較差異顯著，見表1。

表1 2,4-滴丁酯染毒對小鼠睪丸組織T-AOC活力的影響Tab.1 Effects of 2,4-D butylate on the T-AOC activity in the testis tissue of mice

注:a與對照組進(jìn)行比較P﹤0.05；b與低劑量組進(jìn)行比較P﹤0.05；c與中劑量組進(jìn)行比較P﹤0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05;cCompared with the moderate dose group,P<0.05.

2.2 睪丸組織中LDH和SDH的活力

LDH和SDH活力均隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，與對照組和低劑量組相比較，高、中劑量組睪丸組織中LDH活力值較低，差異顯著，且高劑量組與中劑量組比較差異顯著；高、中劑量組睪丸組織中SDH活力與對照組相比較差異顯著，且高劑量組與中、低劑量組比較差異顯著，見表2。

2.3 睪丸組織中Na+K+-ATPase 及Ca++Mg++-ATPase 的活力

與對照組和低劑量組相比較，高、中劑量組睪丸組織中Na+K+-ATPase活力值較低，且差異顯著；實(shí)驗(yàn)組Ca++Mg++-ATPase活力與對照組比較差異顯著，見表3。

表2 2,4-滴丁酯對小鼠睪丸組織中LDH和 SDH活力的影響Tab.2 Effects of 2,4-D butylate on the activities of LDH and SDH in the testis tissue of mice

注:a與對照組進(jìn)行比較P<0.05；b與低劑量組進(jìn)行比較P<0.05；c與中劑量組進(jìn)行比較P<0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05;cCompared with the moderate dose group,P<0.05.

表3 2,4-滴丁酯對小鼠睪丸組織中ATPase 活力的影響Tab.3 Effects of 2,4-D butylate on the activity of ATPase in the testis tissue of mice

注:a與對照組進(jìn)行比較P<0.05；b與低劑量組進(jìn)行比較P<0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05.

3 討論

總抗氧化能力(T-AOC)代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)的總體水平，是反映機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)，主要通過清除自由基及分解過氧化物等，維持體內(nèi)助氧化與抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，使機(jī)體處于氧化還原相對穩(wěn)定的狀態(tài)，且可以克服某種特定抗氧化指標(biāo)難以全面反映組織抗氧化能力的局限性，更能準(zhǔn)確、全面地反映機(jī)體的抗氧化能力[5]。有研究表明2,4-二氯苯氧乙酸類物質(zhì)能夠通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過多的自由基，破壞細(xì)胞膜的完整性，損傷細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系，減少抗氧化酶的含量[6,7]。本次實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸組織中T-AOC活力有隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸下降的趨勢，與高劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，中、低劑量組和對照組睪丸組織中T-AOC活力值較高，且差異顯著。結(jié)果表明中、低劑量的2,4-滴丁酯染毒對小鼠睪丸組織的抗氧化能力影響不大；高劑量2,4-滴丁酯染毒可使T-AOC活力明顯降低說明小鼠體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡被打破，體內(nèi)過多的自由基不能有效的被清除，而對睪丸組織產(chǎn)生了氧化損傷作用。

LDH屬于糖酵解酶系，由生精細(xì)胞產(chǎn)生，存在于曲細(xì)精管胞漿中，其作用是在糖酵解過程中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸， 其活性與生精過程中的能量代謝及生精上皮的成熟密切相關(guān)，是生精細(xì)胞成熟的標(biāo)志酶之一[8]。SDH屬于線粒體的標(biāo)志酶，存在于生精小管的支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的線粒體內(nèi)，其作用是最終將果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖而進(jìn)行能量代謝，在精子的能量代謝過程中起到重要作用，可作為睪丸成熟、精子功能成熟和形態(tài)完善的標(biāo)志酶[9]。因此，LDH和SDH活性變化是反映生殖毒性作用的敏感指標(biāo)之一。本次實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸組織中LDH和SDH活力均隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，且與對照組相比，高、中劑量組LDH和SDH活性顯著性降低，結(jié)果表明高、中劑量的2,4-滴丁酯染毒可通過干擾生殖細(xì)胞的糖酵解和有氧呼吸過程，導(dǎo)致能量的供應(yīng)不足，影響精子的生成與成熟。

ATPase 是廣泛分布在體內(nèi)的生物膜酶系統(tǒng)，是細(xì)胞進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換的重要系統(tǒng)，而Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase是其主要成員。ATPase 是睪丸內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶, 也是質(zhì)膜上重要的離子泵，不僅可以影響能量的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移和利用，還可以維持細(xì)胞膜正常的膜電位變化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此其活性高低是反映機(jī)體能量代謝水平和細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)[10]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase活力均隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高呈下降的趨勢，提示：2,4-滴丁酯染毒可通過抑制睪丸生殖細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換，影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對生殖細(xì)胞造成損傷。

綜上所述，2.4-滴丁酯染毒可引起小鼠睪丸組織內(nèi)T-AOC、LDH、SDH、Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase活性降低，說明2,4-滴丁酯可能通過影響生殖細(xì)胞的抗氧化能力、干擾生殖細(xì)胞糖酵解和有氧呼吸過程影響產(chǎn)能及抑制生殖細(xì)胞對能量的利用，對雄性小鼠睪丸組織發(fā)揮毒性作用。

[1] 孫秀梅, 李憲, 唐維. 重度2,4-滴丁酯中毒搶救 [J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2010, 5(26):190.

[2] Skinner JA, Lewis KA, Bardon KS, et al. An overview of the environmental impact of agriculture in the UK [J]. J Environ Manag, 1997, 50(2):111-128.

[3] Huber A, Bach M, Frede HG. Pollution of surface waters with pesticides in Germany: modeling non-point source inputs [J]. Agric Ecosyst Environ, 2000, 80(3):191-204.

[4] 姚洪波, 陳玉姬, 孫秀玖, 等. 口服 2, 4-滴丁酯 3 例臨床觀察 [J]. 中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 17(1):35-35.

[5] 黃鳳華, 鄭新民, 張?jiān)? 等. 診斷超聲波照射對大鼠睪丸總抗氧化能力、丙二醛及脂質(zhì)過氧化物酶水平和生殖細(xì)胞凋亡的影響 [J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2007, 28(l):85-88.

[6] Nakbi A, Tayeb W, Dabbou S, et al. Hypolipidimic and antioxidant activities of virgin olive oil and its fractions in 2, 4-diclorophenoxyacetic acid-treated rats [J]. Nutrition, 2012, 28(1):81-91.

[7] Troudi A, Sefi M, Ben Amara I, et al. Oxidative damage in bone and erythrocytes of suckling rats exposed to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid [J]. Pesticide Biochem Physiol, 2012, 104(1):19-27.

[8] 徐宏偉, 馬愛國. 維生素A缺乏對大鼠生精能力及睪丸標(biāo)志酶活性的影響 [J]. 中國公共衛(wèi)生, 2002, 18(11):1298-1299.

[9] 李麗萍, 劉秀芳, 寧艷花, 等. DEHP 對大鼠睪丸能量代謝酶的影響及其氧化損傷作用 [J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 1:027.

[10] Gorini A, Canosi U, Devecchi E, et al. ATPases enzyme activities during ageing in different types of somatic and synaptic plasma membranes from rat frontal cerebral cortex [J]. Progr Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2002, 26(1):81-90.

Reproductive toxicity of 2,4-D butylate to male mice

LIU Yan-dong1, SONG Fei-yu2, MA Xiao-ming1, WANG Lin1, MAO Lei1, HONG Di1, SONG Xiang-fu1

(1. School of Public Health of Jilin University, Changchun 130021, China;2. Jilin Connell Pharmaceutical. Co., Ltd, Jilin 132013, China)

Objective To explore the reproductive toxicity of 2,4-D butylate to the testis in male mice．Methods Forty-eight ICR male mice were randomly divided into four groups: the control group, and three 2,4-D butylate experimental groups (10, 20, 40 mg/kg), 12 mice in each group. 2,4-D butylate was intragastrically administered once a day and six days per week for five weeks. At the end of the exposure, the activities of total antioxidant capacity (T-AOC), Na+K+-ATPase, Ca+ +Mg+ +-ATPase, lactate dehydrogenase (LDH) and succinate dehydrogenase (SDH) in testis homogenate were measured by spectrophotometry. Results The activity of T-AOC was gradually decreased with the increase of doses, with a significant difference between the high dose group and other groups. The activities of LDH in the moderate and high dose groups were significantly lower than those of the low dose group and control group, and there was a significant difference between the high dose group and moderate dose group. The activities of SDH in the testis was gradually decreased with the increase of the 2,4-D butylate dose, showing significant differences between the high dose group and the moderate dose and control groups, and between the high and moderate dose groups and the low dose group. The activities of Na+K+-ATPase in the moderate and high dose groups were significantly lower than that of the control and low dose group. The activities of Ca++Mg++-ATPase was significantly lower in the experimental groups than that in the control group. Conclusion Exposure to 2,4-D butylate has certain toxic effect on the testicular tissue in male mice.

2,4-D butylate；Testis；SDH；LDH；ATPase；T-AOC；Reproductive toxicity; Male mice

劉艷冬(1986-)，男， 在讀碩士；研究方向：農(nóng)藥對機(jī)體的影響。E-mail： liu502yandongzly@126.com。

宋飛玉(1975-)，女，研究方向：藥物毒理。E-mail： songfeiyu2008@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0016-03

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.004

2014-05-21