猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸暴露對機(jī)體細(xì)胞免疫的影響

王 衛(wèi)，劉克劍，吳芳新，叢 喆，陳 霆，魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸暴露對機(jī)體細(xì)胞免疫的影響

王 衛(wèi)，劉克劍，吳芳新，叢 喆，陳 霆，魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 研究猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)多次直腸粘膜暴露對機(jī)體細(xì)胞免疫的影響。方法 建立小劑量多次直腸粘膜暴露模型，測定實(shí)驗(yàn)猴的血漿病毒載量了解病毒復(fù)制水平，測定外周CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)了解疾病進(jìn)展情況，測定T細(xì)胞亞群和外周單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ分泌情況了解機(jī)體細(xì)胞免疫狀況。結(jié)果 小劑量SIVmac239病毒多次暴露能導(dǎo)致病毒通過直腸粘膜進(jìn)入動物體內(nèi)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)變化，但未見SIVmac239典型感染。病毒多次直腸暴露誘導(dǎo)出特異性細(xì)胞免疫，但與普通病毒感染相比，水平較低。結(jié)論 本研究明確了猴免疫缺陷病毒小劑量暴露對機(jī)體細(xì)胞免疫的作用，為HIV疫苗研究提供了基礎(chǔ)信息。

SIVmac239；直腸；粘膜；暴露；細(xì)胞免疫

病毒具有致病性和免疫原性兩面性，致病性指病毒具有的破壞寄主并誘發(fā)病害的特性，這是人們研發(fā)病毒疫苗的主要原因。而免疫原性是指病毒能夠刺激宿主機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力，這也是病毒疫苗研發(fā)成功的理論基礎(chǔ)。前期研究表明，HIV病毒感染可產(chǎn)生抗HIV免疫應(yīng)答，但卻不能預(yù)防重復(fù)感染，說明HIV的免疫原性較弱[1, 2]。多次HIV-1病毒的暴露將刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，使其達(dá)到較高的免疫水平，但具體能達(dá)到多高的水平尚未明確。由于HIV-1病毒主要通過性接觸傳播，而且粘膜損傷和粘膜免疫在艾滋病的疾病進(jìn)程發(fā)揮重要作用，因此，了解HIV-1病毒多次粘膜暴露對機(jī)體免疫反應(yīng)就顯得尤為重要。本研究使用SIVmac239感染恒河猴模型，研究艾滋病毒小劑量多次直腸粘膜暴露對機(jī)體的刺激作用，明確艾滋病毒暴露誘發(fā)細(xì)胞免疫情況，為HIV-1疫苗研究提供基礎(chǔ)信息。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

注：病毒攻擊，血樣采集。圖1 小劑量多次組恒河猴直腸粘膜多次病毒暴露示意圖Note.Virus inoculation；blood sample collection.Fig.1 The schematic diagram of multiple exposure with SIVmac239 to the Chinese rhesus by rectal inoculation

中國恒河猴8只，3～4歲，3～5 kg，雌雄各半，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(合格證編號：SCXK(京)2010-0007)。實(shí)驗(yàn)前，經(jīng)血清學(xué)間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴B病毒(BV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)等相關(guān)病原體的感染。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過本單位實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)的動物倫理審查，批準(zhǔn)號為IACUC-MC-12-6005。恒河猴隨機(jī)分成兩組，分別為小劑量多次組和大劑量一次組，每組4只動物。

1.2 毒株及動物接種

SIVmac239病毒由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠贈，由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增和保存[3, 4]。具體的動物接種計(jì)劃：小劑量多次組四只動物通過直腸途徑接種1 mL含10 TCID50SIVmac239的病毒液，每周兩次，共接種12次(6周)，實(shí)驗(yàn)前及每次病毒接種前采集動物靜脈血，見圖1。大劑量一次組四只動物使用5×104TCID50SIVmac239直腸接種，后按時(shí)采集動物靜脈血進(jìn)行檢測。病毒具體接種方法為：動物保持俯臥位，緩慢將病毒液注入肛竇處，保持俯臥位半小時(shí)。

1.3 臨床觀察及樣品采集

每天觀察實(shí)驗(yàn)動物臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、活動情況、攝食量、皮毛以及糞便形態(tài)等。每3～4 d采集恒河猴外周血，監(jiān)測其血漿病毒載量、CD4+T細(xì)胞數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群以及外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)IFN-γ的分泌情況變化等。

1.4 血漿病毒載量測定

TRIzol法提取血漿中病毒RNA，使用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀和TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit (ABI, Cat No. 4392938) 測定血漿病毒RNA載量。總反應(yīng)體系為20 μL，靈敏度為102copies/mL。其中上游引物為gag91F(5′-GCA GAG GAG GAA ATT ACC CAG TAC-3′)，下游引物為gag91R(5′-CAA TTT TAC CCA GGC ATT TAA TGT T-3′)，探針為pSHIVgag91-1(5′-FAM ACC TGC CAT TAA GCC CGA-MGB-3′)[5, 6]。反應(yīng)體系內(nèi)含: TaqMan RT-PCR Mix (2×) 10 μL; TaqMan RT Enzyme Mix (40×) 0.3 μL; 引物gag91F和gag91R (10 μmol/L)各0.5 μL; 探針pSHIVgag91-1 (1 μmol/L) 0.3 μL; DEPC H2O 3.4 μL; 模板5 μL。反應(yīng)條件為: 48℃ 30 min (× 1)，95℃10 min (×1)，94℃ 15 s (×40)，60℃ 60 s (×40)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

取50 μL的EDTA抗凝血，依次加入待標(biāo)記抗體PE-CY7-CD3、PERCP-CY5.5-CD4、APC-CY7-CD8、PE-CD28、APC-CD95，室溫避光作用15 min，全血檢測管加入終濃度10%的紅細(xì)胞裂解液，4℃作用10 min。洗滌2次，細(xì)胞重懸于500 μL的pH 7.2 PBS中，BD FACS-Canto儀上分類計(jì)數(shù)[6]。

PS: 陰影部分為病毒接種期圖2 血漿病毒載量結(jié)果 PS: Shadow area indicates viral inoculation period.Fig.2 The plasma viral load measurements

1.6 IFN-γ ELISPOT

IFN-γ ELISPOT方法使用的是商品化的試劑盒(U-Cytech Biosciences, CT1262T20, Monkey ELISPOT kit, Lot # 65220245)。預(yù)先用抗猴IFN-γ抗體包被96孔平板，4℃過夜，后用含0.05%吐溫20的PBS (PBST) 洗板。加入含1% BSA的PBS 200 μL 37℃封閉1 h。用Ficoll密度梯度離心法分離猴PBMCs，計(jì)數(shù)并用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/mL，將PBMC加入封閉好的96孔板孔中，每孔加入細(xì)胞液100 μL，并加入5 ng/well 濃度的多肽刺激，37℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱孵育24 h時(shí)。孵育結(jié)束后，把細(xì)胞液倒出，用200 μL的冰冷的去離子水處理，后用PBST洗板10次，之后，先后加入生物素化的檢測抗體和GABA結(jié)合的抗生物素抗體孵育37℃1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗板5次。后加入底物室溫顯色15～20 min，顯色完畢，用蒸餾水洗板兩次，干燥，避光保存。陰性對照孔有PBMCs不加入多肽，陽性對照孔用50 ng/mL PMA + 1 μg/mL ionomycin刺激。做好的ELISPOT板通過倒置顯微鏡和ELISPOT讀板儀讀板計(jì)數(shù)。最后，計(jì)算所做復(fù)孔的平均值[7]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

流式數(shù)據(jù)使用Flowjo version 7.2進(jìn)行分析，作圖及統(tǒng)計(jì)分析由Graphpad Prism 5.0完成。

2 結(jié)果

2.1 血漿病毒載量結(jié)果

8只動物分為小劑量多次組和大劑量單次組，分別接種SIVmac239病毒。實(shí)驗(yàn)猴在接受病毒接種的同時(shí)，使用real-time RT-PCR方法檢測實(shí)驗(yàn)動物外周血病毒載量，結(jié)果顯示：小劑量多次組動物在病毒接種期間出現(xiàn)血漿病毒載量，部分時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)病毒載量陽性，但多為一過性病毒血癥，而且病毒復(fù)制水平有限，最高接近106copies/mL，在病毒接種期后兩個(gè)月的觀察期內(nèi)未檢測出病毒載量陽性，見圖2A；而大劑量單次組動物出現(xiàn)典型的SIVmac239病毒感染情況，病毒載量上升迅速到106copies/mL以上，而且維持較高的平臺載量(104～105copies/mL)，見圖2B。前病毒DNA檢測也驗(yàn)證了病毒載量結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 外周CD4+T細(xì)胞數(shù)

為了解小劑量病毒多次暴露對動物外周CD4+T細(xì)胞的影響，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測動物外周血CD4+T細(xì)胞情況。結(jié)果顯示，在病毒刺激粘膜的同時(shí)，小劑量多次組動物外周CD4+T細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)較為劇烈的變化，但未出現(xiàn)明顯下降，甚至部分動物出現(xiàn)上升情況；在病毒接種期后兩個(gè)月的觀察期內(nèi)，外周CD4+T細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)緩慢下降趨勢，見圖3A。而大量劑量一次組動物在病毒接種后迅速下降，并維持于較低水平(500～1 000個(gè)/μL)，見圖3B。說明，病毒小劑量刺激粘膜能進(jìn)入動物體內(nèi)，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的損耗，但可能由于免疫反應(yīng)的存在，CD4+T細(xì)胞損耗的速度較慢。

2.3 記憶T細(xì)胞亞群動態(tài)分析

2.4 PBMC IFN-γ分泌情況

為了解病毒暴露對機(jī)體的影響，本研究使用IFN-γ ELISPOT方法檢測動物細(xì)胞免疫水平，總體來看動物細(xì)胞免疫都出現(xiàn)兩次峰值，小劑量多次組峰出現(xiàn)在28 dpi和56 dpi，而大劑量一次組出現(xiàn)在30 dpi和126 dpi，可見細(xì)胞免疫的開始誘導(dǎo)時(shí)間較為接近，但免疫成熟時(shí)間差異較大。此外，從免疫強(qiáng)度來看，每只動物均檢測出特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但每組動物的結(jié)果都顯示很大差異，小劑量多次組動物明顯小于大劑量一次組動物，包括初次誘導(dǎo)和成熟階段。說明，小劑量病毒粘膜暴露能刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但強(qiáng)度較小(圖5)。

PS: 陰影部分為病毒接種期圖3 外周CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 PS: Shadow area indicates viral inoculation period.Fig.3 The results of peripheral CD4+ T cell count

圖4 實(shí)驗(yàn)猴記憶T細(xì)胞動態(tài)分析Fig.4 Dynamic analysis of the monkey memory T cells

圖5 實(shí)驗(yàn)猴PBMC IFN-γ分泌情況Fig.5 Dynamic analysis of the IFN-γ secretion of PBMCs

圖6 IFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of the IFN-γ ELISPOT assay

在此基礎(chǔ)上，本研究還對誘發(fā)小劑量多次組動物細(xì)胞免疫的多肽片段進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，感染之初大部分時(shí)間點(diǎn)以針對Env的細(xì)胞免疫最強(qiáng)，這與Env位于病毒表面有關(guān)，但到后期針對Env的細(xì)胞免疫開始下降，可能與病毒包膜的高變異率有關(guān)；到12周之后，針對Gag的細(xì)胞免疫開始上升，這應(yīng)該與Gag是病毒的保守核心有關(guān)。在這個(gè)過程中，針對Pol的細(xì)胞免疫均較弱，可能是由于病毒pol基因的變異程度較大有關(guān)(圖6)。

3 討論

在HIV研究中，艾滋病毒多次暴露能降低病毒感染的機(jī)率是肯定的，但艾滋病毒暴露抑制感染的保護(hù)機(jī)制陷入了爭議。研究表明，活化的免疫系統(tǒng)應(yīng)該能夠通過中和抗體，抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，尤其是抗病毒的CD8+T細(xì)胞(CTL)清除或抑制宿主病毒的感染。Haase等[8]人研究表明，宿主中產(chǎn)生的抗病毒抗體可能防止艾滋病毒的感染；Barker等[9]人研究表明，CD8+T細(xì)胞能建立PBMC的抵抗力以致阻止宿主的再次感染。Yeh等人研究表明，細(xì)胞免疫水平和體液免疫水平與重復(fù)感染沒有相關(guān)性，推測其他免疫作用可能參與了超感染的保護(hù)作用，天然免疫系統(tǒng)的作用也應(yīng)該被考慮在內(nèi)[10]。

由于HIV的種屬特異性，目前缺乏HIV感染動物模型，常用的艾滋病動物模型為SIV感染模型和猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)感染模型。鑒于SHIV病毒為人工改造病毒，本研究選擇SIV病毒進(jìn)行動物免疫接種。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作經(jīng)驗(yàn)，選擇10 TCID50作為免疫劑量，一方面避免了大劑量病毒迅速感染動物，另一方面可確保有足夠的病毒影響動物，刺激機(jī)體反應(yīng)。

本研究中，使用SIVmac239病毒小劑量多次直腸粘膜暴露，不斷刺激機(jī)體免疫，使其達(dá)到較高水平，并與正常感染猴進(jìn)行比較。血漿病毒載量未見典型感染癥狀，說明病毒多次暴露刺激機(jī)體產(chǎn)生了部分保護(hù)作用，抑制后續(xù)病毒感染和復(fù)制。CD4+T細(xì)胞數(shù)也未見急性期的急劇下降，說明前期病毒暴露阻止了后期病毒的急性感染。但其具體作用機(jī)制不明。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，根據(jù)其分化、歸巢、表面分子及功能的不同，可分為na?ve T細(xì)胞(TN)、中心記憶T細(xì)胞(TCM)和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM)三種，其中CD4+TCM是艾滋病毒的主要靶細(xì)胞，其與艾滋病的疾病進(jìn)程、病毒復(fù)制等密切相關(guān)，CD4+TN是CD4+TCM主要分化源泉；CD8+TEM是主要的效應(yīng)殺傷細(xì)胞。在本研究中，為進(jìn)一步探索是否這種隱匿性感染還能誘發(fā)疾病進(jìn)展，本研究檢測了動物的CD4+TCM細(xì)胞，結(jié)果該細(xì)胞群逐漸下降，說明這種隱匿性感染仍存病毒和機(jī)體的相互斗爭，而且病毒仍占據(jù)上風(fēng)，導(dǎo)致病毒靶細(xì)胞CD4+TCM和效應(yīng)CD8+TEM細(xì)胞顯下降趨勢，但在一年的觀察期內(nèi)動物均維持健康狀況，說明動物顯慢性進(jìn)展型。

此外，為了解病毒多次粘膜暴露對細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響，使用IFN-γ ELISPOT方法測定動物細(xì)胞免疫狀況，發(fā)現(xiàn)針對病毒核心Gag的細(xì)胞免疫最強(qiáng)，但整體而言，病毒多次暴露在病毒接種期間和之后的細(xì)胞免疫均較弱，這可能是由病毒復(fù)制水平低，免疫原不多導(dǎo)致，也可說明病毒抑制與細(xì)胞免疫的壓制關(guān)系不大。因此，需要進(jìn)一步探索其他免疫機(jī)制對病毒復(fù)制抑制的作用。

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Effect of repeated rectal exposure of low-dose simian immunodeficiency virus on the systemic cellular immunity in monkeys

WANG Wei, LIU Ke-jian, WU Fang-xin, CONG Zhe, CHEN Ting, WEI Qiang

(Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC) & Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS); Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models,State administration of Traditional Chinese medicine, Beijing 100021, China)

Objective To study the effect of repeated rectal exposure of low-dose simian immunodeficiency virus on the systemic cellular immunity in monkeys. Methods Eight 3- to 4-year old rhesus macaques (Macacamulatta) (male:female 1:1) were used in this study. The monkeys were inoculated with 10 TCID50SIVmac239 virus through rectum twice a week for consecutive 6 weeks to establish a multiple rectal exposure model of SIVmac239 virus infection. Then, plasma viral load, CD4+T cell count, T cell subsets and IFN-γ secretion of the experiment monkeys were determined. Results Low-dose SIVmac239 virus induced some changes in the immune system through the rectal mucosa, but didn’t induce typical infection. Repeated rectal mucosal low-dose virus exposure can activate the cellular immune system. Conclusions This study defines the effect of repeated low-dose simian immunodeficiency virus exposure on the systemic cellular immunity, and provided basic information for HIV-1 vaccine research.

Simian immunodeficiency virus, SIVmac239; Exposure; Rectal mucosa; Cellular immunity; Monkey

國家科技重大專項(xiàng)課題(2012ZX10004501-001, 2013ZX10004608-003, 2012ZX10001006-003)。

王衛(wèi)(1981- )，男，碩士，助理研究員，比較醫(yī)學(xué)專業(yè)。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物病毒學(xué)。Email: weiqiang0430@sohu.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.001

2014-05-27