珊瑚狀猴頭菌多糖對(duì)大鼠肝抗氧化及代謝調(diào)節(jié)*

唐 鵬，李學(xué)英，王大忠，馮翠萍，韓愛(ài)麗

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563003；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

珊瑚狀猴頭菌多糖對(duì)大鼠肝抗氧化及代謝調(diào)節(jié)*

唐 鵬1，李學(xué)英1，王大忠1，馮翠萍2**，韓愛(ài)麗2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563003；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

探討珊瑚狀猴頭菌多糖的抗氧化作用和對(duì)大鼠肝臟代謝的相關(guān)基因表達(dá)的影響。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、多糖干預(yù)組和模型組。對(duì)照組喂飼基礎(chǔ)飼料，多糖干預(yù)組(劑量1組、劑量2組)和模型組喂飼高膽固醇飼料，同時(shí)多糖干預(yù)組(劑量1組、劑量2組)給予多糖灌胃5周，5周后處死大鼠取肝臟。分別測(cè)定大鼠肝臟的丙二醛(MDA)含量，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)的活力。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)大鼠肝臟相關(guān)基因表達(dá)量：酰輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2(ACAT2)、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)。與模型組比較：多糖劑量1組、劑量2組大鼠肝臟的MDA含量顯著下降(p<0.01)，T-SOD活力顯著升高(p<0.01)，GSH-Px活力顯著升高(p<0.01)，CAT活力顯著提高(p<0.01)；多糖劑量1組、多糖劑量2組大鼠肝臟的基因表達(dá)量ACAT2 mRNA顯著下降(p<0.01)；LCAT mRNA顯著升高(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖具有顯著的抗氧化作用，對(duì)大鼠肝臟的代謝具有調(diào)節(jié)作用。

珊瑚狀猴頭菌；多糖；膽固醇；基因表達(dá)；抗氧化性；代謝；肝臟

食用菌集各種營(yíng)養(yǎng)于一身，是當(dāng)前人類(lèi)最有發(fā)展前途、最具希望的健康食品?；钚远嗵堑淖罴逊N類(lèi)來(lái)自真菌多糖，其廣泛的生物活性已逐漸被人們認(rèn)知。食用菌多糖是功效十分顯著的生物活性物質(zhì)，是食藥兼用菌中所含的最重要的藥效成分，在國(guó)內(nèi)外被稱(chēng)為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”。隨著人們生活水平的提高，健康保健意識(shí)逐漸增強(qiáng)，作為藥食同源的食用菌，其多糖的研究日益受到研究者關(guān)注。

真菌多糖是1種從真菌中提取獲得的安全無(wú)毒的天然高分子聚合物[1]。目前已經(jīng)開(kāi)展了靈芝、茶樹(shù)菇、猴頭菇等食用菌多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。我國(guó)是最早栽培和利用食用菌的國(guó)家之一，資源非常豐富。大量的研究表明，食用菌的生物活性主要來(lái)自其多糖和多糖肽類(lèi)，食用菌多糖能明顯降低心肌組織的脂褐質(zhì)含量，增強(qiáng)體內(nèi)SOD酶(超氧化物歧化酶)活力，從而清除體內(nèi)氧自由基等有害物質(zhì)，具有良好的清除自由基功效，達(dá)到延緩衰老的效果[2]。隨著一系列新型的、安全高效的真菌多糖藥物和保健品迅速進(jìn)入市場(chǎng)，毒副作用小、效率高的食用菌多糖越來(lái)越受到人們的重視。

高脂血癥的發(fā)病率逐年升高，究其原因，脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致高血脂的直接原因，如何預(yù)防和治療高膽固醇血癥成為當(dāng)前研究的重要課題。肝臟是合成脂肪酸和脂肪的主要場(chǎng)所，也是人體中合成膽固醇最旺盛的臟器，是血漿膽固醇的主要來(lái)源。此外，肝臟還合成并分泌卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)，促使膽固醇酯化。膽固醇生物合成的原料是乙酰輔酶A，膽固醇的分解代謝也在肝臟內(nèi)進(jìn)行。膽固醇在體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當(dāng)其動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，膽固醇過(guò)量會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，脂質(zhì)代謝失調(diào)。高膽固醇是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的主要危險(xiǎn)因素之一，血漿膽固醇含量與冠心病及心肌梗塞的發(fā)生率呈正相關(guān)[3]。近年來(lái)有研究表明靈芝、香菇、黑木耳、猴頭菇等食用菌多糖具有防治高血糖、高血脂的作用，紅菇多糖能顯著降低糖尿病小鼠的血糖值，同時(shí)甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇顯著降低[4]。金耳多糖可以顯著降低鏈脲霉素所致糖尿病小鼠血液中總膽固醇(TC)含量，其機(jī)理可能是多糖抑制了總膽固醇(TC)的吸收[5]。

猴頭菌屬多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗凝血、降血脂等功效[6]，但目前關(guān)于珊瑚狀猴頭菌(Hericiumcoralloides)多糖的抗氧化作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道,對(duì)大鼠肝臟ACAT2、LCAT影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用珊瑚狀猴頭菌提取了水溶性好、安全無(wú)毒副作用的多糖，對(duì)多糖進(jìn)行抗氧化及大鼠肝臟代謝調(diào)節(jié)的作用研究，旨在為珊瑚狀猴頭菌來(lái)源的新型高效多糖制劑研發(fā)及其深度開(kāi)發(fā)利用提供可借鑒的技術(shù)資料。

1 材料和儀器

1.1 材料

受試動(dòng)物及分組SD雄性大鼠，32只，體重(100±10)g, 清潔級(jí)，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、多糖干預(yù)組(劑量1組、2組)和模型組4個(gè)組。

1.2 飼養(yǎng)條件

基礎(chǔ)飼料、高膽固醇飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件符合標(biāo)準(zhǔn)[室溫(24±1)℃，相對(duì)濕度(55±10)%，12 h避光，每籠4只，自由飲水進(jìn)食，每天清洗飲水瓶、添加飼料，及時(shí)清除霉變和污染飼料等，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常組喂飼基礎(chǔ)飼料，其它各組喂飼高膽固醇飼料]。

1.3 主要儀器

FA1204B型電子分析天平(北京)；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海)；BS210S型電子天平(北京)；DL-1型電子萬(wàn)用爐(天津)；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海)；TDA-8002型電熱恒溫水浴鍋(北京)；XW-80A型漩渦混合器(上海)；751G型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海)；BSC-1000 II A2型生物安全柜(北京)；高速電動(dòng)勻漿機(jī)(天津)；數(shù)顯電熱恒溫烘箱(北京)；標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(德國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(意大利)；可調(diào)式微量移液槍(德國(guó))；Y96000型電子分析天平(上海)；ABI9700型普通PCR儀(美國(guó))；5804R型冷凍離心機(jī)(德國(guó))；DZKW-D-1型電熱恒溫水浴鍋(北京)；Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó))；BIO safe 12型生物安全柜(北京)；核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó))；超低溫冰箱(日本)；透析袋(上海)；冷凍干燥機(jī)(北京)。

1.4 主要試劑

超氧化物歧化酶SOD(Superoxide Dismutase)試劑盒、丙二醛MDA(Maleic Dialdehyde)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px測(cè)定試劑盒、CAT(Catalase)試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒，試劑盒均為南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)試劑盒、SYBR(r) Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，均為大連寶生公司產(chǎn)品；DEPC，加拿大BIO BASIC INC公司；PCR引物合成，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸、葡萄糖常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.5 原料

珊瑚狀猴頭菌粉：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。

2 方法

2.1 珊瑚狀猴頭菌多糖提取流程

珊瑚狀猴頭菌粉→熱水浸提→過(guò)濾→離心(棄去殘?jiān)羯锨逡?→乙醇沉淀 → 離心(棄去上清液)→(丙酮、乙醚)脫脂→透析→冷凍干燥→珊瑚狀猴頭菌多糖。

稱(chēng)取珊瑚狀猴頭菌干粉適量，以1∶40的料水比加蒸餾水，90℃恒溫水浴浸提3 h；濾紙過(guò)濾；離心取上清液( 4 000 r·min-1，10 min)，濃縮，重復(fù)浸提1次然后加入4倍體積的乙醇，靜置過(guò)夜。再進(jìn)行離心，所得沉淀依次用丙酮、乙醚洗滌3次，烘干至質(zhì)量恒定，取其適量用蒸餾水充分溶解，溶液置于透析袋中，用自來(lái)水淋洗48 h，再用蒸餾水透析24 h，然后用3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀多糖，靜置過(guò)夜， 4 000 r·min-1離心10 min后取沉淀，冷凍干燥至質(zhì)量恒定，即為含糖量為75.28%的珊瑚狀猴頭菌多糖。以備實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 給藥方式

實(shí)驗(yàn)將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、多糖劑量1組(200 mg·kg-1)、多糖劑量2組(100 mg·kg-1)、模型組共4個(gè)組，每組8只大鼠；多糖干預(yù)組給藥：根據(jù)大鼠體重將珊瑚狀猴頭菌多糖溶液按設(shè)定的劑量每天定時(shí)給大鼠灌胃1mL，同時(shí)對(duì)照組和模型組大鼠用生理鹽水灌胃1mL；動(dòng)物連續(xù)給藥5周后，于末次給藥12 h后處死大鼠并取其肝臟。

2.3 珊瑚狀猴頭菌多糖抗氧化作用研究

各組大鼠取肝臟200 mg進(jìn)行勻漿，離心、沉淀，用于SOD、CAT、MDA、GSH-Px的測(cè)定，測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 Real time PCR檢測(cè)ACAT2 mRNA和LCAT mRNA的表達(dá)量

依試劑盒說(shuō)明書(shū),采用Trizol試劑盒提取肝臟總RNA；Taq-ManReverse Transcription Reagents試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，其mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法[7]。

大鼠β-actin、LCAT、ACAT2 mRNA序列來(lái)源 (Gene Bank)，應(yīng)用Primer5plμs引物設(shè)計(jì)平臺(tái)設(shè)計(jì)試驗(yàn)引物，深圳華大基因有限公司合成。其引物序列、產(chǎn)物大小及位置見(jiàn)表1。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及位置

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

大鼠肝臟SOD、CAT、MDA、GSH-Px含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠肝臟的SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(p<0.01)，MDA含量顯著升高(p<0.01)。與模型組相比，劑量1組、劑量2組大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高，MDA含量顯著下降(p<0.01)。

大鼠肝臟的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，模型組和對(duì)照組相比，大鼠肝臟ACAT2 mRNA的表達(dá)量顯著升高(p<0.01)；肝臟LCAT mRNA的表達(dá)量顯著降低(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖可下調(diào)ACAT2 mRNA的表達(dá)，劑量1組、劑量2組與模型組相比有顯著差異(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖可上調(diào)LCAT mRNA的表達(dá)，劑量1組和劑量2組與模型組相比有顯著差異(p<0.01)。

表2 大鼠肝臟抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

注：劑量1、劑量2組與模型組相比，*p<0.01，#p<0.05；模型組與對(duì)照組相比，*p<0.01，#p<0.05。

表3 大鼠肝臟ACAT2mRNA和 LCATmRNA相對(duì)表達(dá)量

注：劑量1、劑量2組與模型組相比，*p<0.01，#p<0.05；模型組與對(duì)照組相比，*p<0.01，#p<0.05。

4 討論

在食藥用真菌類(lèi)發(fā)現(xiàn)的抗氧化活性物質(zhì)，為氧化損傷相關(guān)疾病的治療帶來(lái)了新的希望，成為研發(fā)安全高效天然抗氧化劑值得關(guān)注的新途徑。目前已經(jīng)在靈芝、茶樹(shù)菇、猴頭菇等食用菌中展開(kāi)了其多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，香菇、靈芝、猴頭菇等食用菌多糖能夠清除超氧自由基、DPPH、羥基自由基等自由基對(duì)人體的傷害，具有極強(qiáng)的抗氧化活性[8]。猴頭菌絲多糖能明顯提高小鼠血清、大腦、肝臟中SOD、CAT的含量，明顯降低小鼠大腦、肝臟MDA水平，具有重要的抗氧化、延緩衰老功能[9]。

食用菌類(lèi)多糖具有重要的生物學(xué)功能，具有抗氧化等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于珊瑚狀猴頭菌多糖的抗氧化及對(duì)大鼠肝臟代謝調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究。過(guò)量的自由基(Free radical)可對(duì)生物大分子、細(xì)胞器、細(xì)胞等造成累積性氧化損傷，導(dǎo)致組織損傷和器官功能衰退，誘導(dǎo)及加速機(jī)體衰老。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)[10]。膽固醇、甘油三酯過(guò)高及血管壁上過(guò)多的脂類(lèi)容易被自由基氧化，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)在血管壁沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)[11]。多糖可通過(guò)提高SOD、CAT、GSH-Px等酶的活力從而發(fā)揮抗氧化的作用[12]。

LCAT能夠抑制LDL氧化過(guò)程中的負(fù)電荷增加，防止在脂蛋白氧化過(guò)程中脂質(zhì)被氧化。實(shí)驗(yàn)表明多糖可顯著提高機(jī)體內(nèi)LCAT活性，加速體內(nèi)過(guò)剩膽固醇的清除。還可以顯著提高機(jī)體內(nèi)GSH-Px和SOD活力，抑制MDA升高，體內(nèi)在SOD、CAT和GSH-Px的共同作用下清除超氧陰離子、羥自由基及過(guò)氧化氫，減輕或阻斷過(guò)氧化物損傷。可能阻止HDL被氧化，從而保證體內(nèi)過(guò)剩的膽固醇順利排出。膽固醇酯分子較大，難以透過(guò)細(xì)胞膜，因此易被HDL分子運(yùn)至肝臟清除[13]。

LCAT的活性有利于膽固醇的清除，可將細(xì)胞外高密度脂蛋白(HDL)的游離膽固醇酯化，高密度脂蛋白主要功能是將外圍組織和血液中的膽固醇運(yùn)送至肝臟進(jìn)行代謝，被稱(chēng)為清道夫，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇喂飼對(duì)大鼠肝臟LCATmRNA、ACAT2mRNA的表達(dá)有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)珊瑚狀猴頭菌多糖對(duì)于大鼠肝臟卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)有調(diào)節(jié)作用，LCAT活性提高，可促使HDL2-C合成將外周組織的游離膽固醇轉(zhuǎn)移至肝臟代謝。且LCAT的活性直接影響到機(jī)體內(nèi)過(guò)剩膽固醇的清除速度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，珊瑚狀猴頭菌多糖可以有效下調(diào)肝臟細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化關(guān)鍵酶ACAT2mRNA的表達(dá)。

膽固醇酯化家族主要包括 ACAT1、ACAT2和LCAT[15]。ACAT2只在肝臟和小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，主要參與膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配。ACAT2是1種可被誘導(dǎo)表達(dá)的酶，主要分布于小腸上皮細(xì)絨毛頂端和肝臟細(xì)胞內(nèi)，催化膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯。成年人的肝臟正常情況下ACAT2活性較低，ACAT2的作用是保護(hù)肝細(xì)胞免受過(guò)剩膽固醇的損害。ACAT2催化膽固醇酯合成主要與膽固醇吸收及乳糜微粒的合成有關(guān)， ACAT2在肝細(xì)胞中所提供的膽固醇酯與脂蛋白分泌有關(guān)[16]。ACAT2低活性對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，ACAT2水平的調(diào)節(jié)對(duì)于脂質(zhì)代謝非常重要，ACAT2被視為高膽固醇血癥的一個(gè)重要靶標(biāo)[17]。特異性抑制ACAT2，能有效地降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量，且不會(huì)影響動(dòng)物的正常生理功能?？勺柚剐∧c對(duì)膽固醇的吸收和肝臟對(duì)膽固醇的酯化，降低血漿中膽固醇水平，預(yù)防和治療AS。低密度脂蛋白被視為AS的主要危險(xiǎn)因素，ACAT2具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝及VLDL合成分泌作用[18]。

綜上所述，珊瑚狀猴頭菌作為食品功能因子，是一種應(yīng)用前景廣闊的真菌，具有極為重要的醫(yī)療、營(yíng)養(yǎng)保健等應(yīng)用價(jià)值。體內(nèi)膽固醇代謝異常是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，本實(shí)驗(yàn)表明，珊瑚狀猴頭菌多糖具有抗氧化作用，通過(guò)下調(diào)大鼠肝臟的ACAT2mRNA的表達(dá)和上調(diào)LCATmRNA的表達(dá)而具有顯著的代謝調(diào)節(jié)作用，加上食用菌多糖幾乎無(wú)毒副作用的特點(diǎn)，因此，珊瑚狀猴頭菌多糖也是一種新型高效安全的天然多糖制劑，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品的研制。

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Effect on Antioxidant and Regulation of Hepatic Metabolism in Rats ofHericiumcoralloidesPolysaccharide

TANG Peng1, LI Xue-ying1, WANG Da-zhong1, FENG Cui-ping2, HAN Ai-li2

(1.Zunyi Medical University, Department of Cell Biology and Genetics, ZunyiGuizhou563003; 2.Shanxi Agricultural University, College of Food Science and Engineering, JinzhongShanxi030801)

The effect of antioxidant and the expression of related genes in rat liver metabolism ofHericiumcoralloidespolysaccharide were explored. The rats were randomly divided into control group, intervention group and control group of polysaccharides. The control group was fed with basic feed, polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) and model group fed with high cholesterol diet, and polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) gave polysaccharide orally for 5 weeks, the rats were killed after 5 weeks of livers. Rat liver MDA content, superoxide dismutase (T-SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activity were measured. Real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect the gene expression related to rat liver index: A acetyl CoA: cholesterol acyltransferase2 (ACAT2), lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT). The results showed that compared with the model group, polysaccharide dose group 1 and group 2 doses of MDA content significantly decreased in rat liver(p<0.01), T-SOD activity increased significantly (p<0.01), GSH-Px activity increased significantly (p<0.01), and CAT activity was significantly improved (p<0.01). Liver gene expression index of polysaccharide dose group 1 and group 2, ACAT2 mRNA decreased significantly(p<0.01), and LCAT mRNA increased significantly (p<0.01). TheHericiumcoralloidespolysaccharide had significant antioxidant effect, which had regulatory effect on metabolism in rat liver.

Hericiumcoralloides; Polysaccharides; Cholesterol; Gene expression; Antioxidant capacity; Metabolism; Liver

*項(xiàng)目來(lái)源：山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“姬松茸多糖對(duì)鉛中毒大鼠免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的研究”(2010011043-1)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目“珍稀菇類(lèi)姬松茸、茶薪菇、靈芝的研究開(kāi)發(fā)和利用”(021025)。

唐鵬(1987-)，男，在讀碩士研究生，主要從事生物藥效學(xué)研究。E-mail：tpweb@126.com

**通信作者： 馮翠萍，教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究。E-mail：ndfcp@163.com

2014-03-25

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0048-04