丁草胺污染對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響

張仕穎，夏運(yùn)生，肖煒，崔曉龍，王永霞，史靜，張乃明*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南大學(xué)云南省微生物研究所，云南 昆明 650091

云南永勝濤源鄉(xiāng)是保持我國(guó)水稻小面積超高產(chǎn)紀(jì)錄的特殊生態(tài)區(qū)。大量研究表明，這里不斷刷新的水稻高產(chǎn)紀(jì)錄得益于當(dāng)?shù)氐锰飒?dú)厚的自然生態(tài)條件（Ying等, 1998a；Ying等, 1998b；Katsura等, 2008；Li等, 2009），尤其是土壤微生物，在其中起到至關(guān)重要的作用（段紅平等，2007；李進(jìn)學(xué)等，2007）。土壤微生物與土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性存在關(guān)聯(lián)（Tilman等, 1996；Griffiths等, 2000），并且具有改善土壤質(zhì)量，提高生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的功能（Aboim等, 2008），因此可將土壤微生物作為靈敏的反映指標(biāo)，表征土壤質(zhì)量的演變趨勢(shì)（張乃明，2013）。丁草胺是亞洲應(yīng)用最廣泛的苯乙酰胺類除草劑（Kumari等, 2009），與乙草胺和草甘膦并稱我國(guó)三大除草劑（Xu等, 2005）。丁草胺主要應(yīng)用于水稻田，對(duì)禾本科雜草有較好的防除效果，但由于使用量大，且直接毒土，不可避免地會(huì)在土壤和環(huán)境中殘留，破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，影響水稻產(chǎn)量（余保文和朱誠(chéng)，2008；韓玉軍和趙長(zhǎng)山，2012）。濤源特殊生態(tài)區(qū)常年使用丁草胺作為水稻選擇性芽前除草劑，大量施用的除草劑究竟會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成多大影響成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。目前關(guān)于丁草胺對(duì)普通水稻土微生物區(qū)系影響的研究較多（Min等, 2001；Suseela, 2001；Chen等,2009），但針對(duì)高產(chǎn)水稻土僅見從微生物功能多樣性角度探索的相關(guān)報(bào)道（張仕穎等，2013）。本研究重點(diǎn)關(guān)注土壤微生物3大類群和3類常見有益功能微生物，探討模擬條件下丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響，可為系統(tǒng)評(píng)價(jià)丁草胺的生態(tài)毒理效應(yīng)提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 供試藥品

50%丁草胺乳油，上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)，農(nóng)藥登記號(hào)：D20091403，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：HG 3292—2001；施用方法：藥土法。

1.2 土壤含水量測(cè)定

稱取30～40 g（精確到0.01 g）新鮮土樣置于培養(yǎng)皿中，放入110 ℃烘箱烘烤6 h，取出稱質(zhì)量；之后重新放回烘箱繼續(xù)烘烤，每隔30 min重復(fù)稱質(zhì)量一次，直至恒質(zhì)量，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。土壤含水量計(jì)算公式為：

其中：m0表示烘干前樣品質(zhì)量，g；m1表示烘干后樣品質(zhì)量，g；wH2O表示土壤含水量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%）。

1.3 丁草胺處理

丁草胺的合理施用標(biāo)準(zhǔn)為有效成分濃度747～1278 g·hm-2（國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2002），折算合每千克干土 0.216～0.370 mg，本研究取中間質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30 mg·kg-1作為100%推薦劑量。稱取相當(dāng)于500 g干質(zhì)量的新鮮土樣，加入超純水使其含水量為田間最大持水量的 60%，在室內(nèi)模擬條件下，添加以超純水稀釋的丁草胺乳油，使其在土樣中的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 50%推薦劑量(0.15 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱 B15)、100%推薦劑量(0.30 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱 B30)和 500%推薦劑量(1.5 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱B150)，攪拌均勻，另設(shè)不加丁草胺的處理為對(duì)照（0 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱CK），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。所有處理密封，置于恒溫培養(yǎng)箱(25±1)℃中避光培養(yǎng)，于藥劑處理后7、15、30、45 d取樣測(cè)定，每隔2～3 d用差減法補(bǔ)充水分以調(diào)節(jié)含水量，供試土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.89 g·kg-1，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.30 g·kg-1，全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.67 g·kg-1，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為101.65 mg·kg-1，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.80 mg·kg-1，速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 142.91 mg·kg-1，pH 7.84。

1.4 樣品測(cè)定方法

分離好氧細(xì)菌（aerobic bacteria）使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、真菌（fungi）使用馬丁氏培養(yǎng)基、放線菌（actinobacteria）使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，分離自生固氮菌（nitrogen fixing bacteria）使用 Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基、磷酸鹽溶解菌（phosphate solubilizing bacteria）使用無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌（silicate dissolving bacteria）使用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基（國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2006；鐘傳青，2004），所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)至pH 7.5～8.0。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理，采用單因素（one way ANOVA）方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌數(shù)量的影響

從圖1可以看出，不同施藥濃度對(duì)好氧細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生的影響不完全相同。施藥7 d，100%和 500%推薦劑量表現(xiàn)出明顯的刺激促生長(zhǎng)作用，B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量均與CK達(dá)到顯著差異，比CK分別高出78.6%和153.8%；施藥15 d和30 d，B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量迅速下降至CK以下，表現(xiàn)出抑制好氧細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖的態(tài)勢(shì)；施藥45 d，抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，B30和B150的好氧細(xì)菌數(shù)量已經(jīng)顯著低于 CK；此外，50%推薦劑量B15的好氧細(xì)菌數(shù)量則變化不大，4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)均顯示與CK基本保持在同一水平，沒有出現(xiàn)明顯的波動(dòng)?？v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期，中、高濃度丁草胺對(duì)土壤好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的作用，低劑量丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌生長(zhǎng)則沒有太大影響。

圖1 不同濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of different concentration of butachlor on bacteria number

2.2 丁草胺對(duì)放線菌數(shù)量的影響

從圖2可以看出，施藥7 d，B150表現(xiàn)出明顯的刺激促生長(zhǎng)作用，其放線菌數(shù)量顯著高于 CK，差值達(dá)到75.1%，B15和B30則表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其放線菌數(shù)量顯著低于 CK，差值分別達(dá)到74.5%和69.1%；施藥15 d，B150的刺激作用和B15的抑制作用明顯減弱，恢復(fù)到與CK相當(dāng)水平，B30則表現(xiàn)出對(duì)放線菌生長(zhǎng)明顯的刺激作用，其放線菌數(shù)量比CK高出125.0%，達(dá)到顯著差異；之后所有丁草胺處理的放線菌數(shù)量均保持在顯著低于CK的水平，表現(xiàn)出明顯的抑制作用?？v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期，中高濃度丁草胺對(duì)放線菌的生長(zhǎng)有明顯的刺激作用，丁草胺濃度越高，刺激作用表現(xiàn)得越快越明顯，之后隨著丁草胺的自然降解，刺激作用逐漸轉(zhuǎn)化為抑制作用，低濃度丁草胺對(duì)放線菌生長(zhǎng)則主要表現(xiàn)為抑制作用。

圖2 不同濃度丁草胺對(duì)放線菌數(shù)量的影響Fig. 2 Effect of different concentration of butachlor on actinomyces number

圖3 不同濃度丁草胺對(duì)真菌數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of different concentration of butachlor on fungi number

2.3 丁草胺對(duì)真菌數(shù)量的影響

從圖3可以看出，不同濃度丁草胺對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響不同。施藥7 d，B30和B150顯著低于CK，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其真菌數(shù)量分別比CK低16.8%和43.6%；施藥15 d，B30的真菌數(shù)量顯著提高，超過(guò)CK56.9%，其余2個(gè)處理則與CK沒有顯著差異；施藥30和45 d，B15和B30的真菌數(shù)量與CK處在同一水平，沒有明顯差異，B150則顯著低于CK，30 d時(shí)比CK低27.8%，45 d時(shí)比CK低22.7%。縱觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期，低濃度丁草胺B15對(duì)土壤真菌的生長(zhǎng)和增殖基本沒有影響，中等濃度B30則表現(xiàn)為先抑制后刺激的作用，隨著丁草胺的自然降解，抑制和刺激作用都會(huì)消失，其真菌數(shù)量可恢復(fù)到CK水平；高濃度丁草胺B150則始終表現(xiàn)為抑制作用，其真菌數(shù)量與CK之間存在明顯差異。

圖4 不同濃度丁草胺對(duì)自生固氮菌數(shù)量的影響Fig. 4 Effect of different concentration of butachlor on nitrogen-fixingbacteria number

2.4 丁草胺對(duì)自生固氮菌數(shù)量的影響

從圖 4可以看出，不同劑量丁草胺施入土壤對(duì)自生固氮菌均表現(xiàn)為先刺激、后抑制的作用。施藥7 d，所有丁草胺處理自生固氮菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照，B15、B30和 B150比 CK分別高出237.1%，179.9%和138.1%，刺激作用顯著。施藥15 d，中低劑量處理自生固氮菌數(shù)量仍顯著高于CK，但刺激作用明顯減弱，B15和 B30分別比CK高出55.9%和20.9%，B150自生固氮菌數(shù)量則下降至與CK無(wú)顯著差異，高劑量刺激作用消失。施藥30 d，B15和B30自生固氮菌數(shù)量繼續(xù)下降，與CK無(wú)顯著差異，B150則繼續(xù)下降至CK以下29.6%，達(dá)到差異顯著，此時(shí)中低劑量丁草胺對(duì)自生固氮菌的促生長(zhǎng)作用已消失，高劑量則表現(xiàn)出對(duì)自生固氮菌的抑制作用。施藥45 d，基本情況與30 d時(shí)相似，中高劑量處理自生固氮菌數(shù)量進(jìn)一步減少，B30和 B150比 CK分別低 20.5%和35.9%，抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.5 丁草胺對(duì)磷酸鹽溶解菌數(shù)量的影響

圖5 不同濃度丁草胺對(duì)磷酸鹽溶解菌數(shù)量的影響Fig. 5 Effect of different concentration of butachlor on phosphate solubilizing bacteria number

圖6 不同濃度丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響Fig. 6 Effect of different concentration of butachlor on silicate dissolving bacteria number

從圖5可以看出，不同濃度丁草胺施入土壤會(huì)對(duì)磷酸鹽溶解菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用?？v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期，500%推薦劑量B150的磷酸鹽溶解菌數(shù)量始終處于一個(gè)較低的水平，磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖受到強(qiáng)烈抑制；100%推薦劑量B30的磷酸鹽溶解菌數(shù)量也始終顯著低于 CK，但其抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)不及 B150處理明顯；50%推薦劑量B15對(duì)磷酸鹽溶解菌則表現(xiàn)出微弱的抑制作用，雖然其磷酸鹽溶解菌數(shù)量在整個(gè)丁草胺處理時(shí)期均低于 CK，但都未達(dá)到顯著差異?？梢娛┯枚〔莅窌?huì)對(duì)高產(chǎn)水稻土磷酸鹽溶解菌群落產(chǎn)生不利影響，能夠抑制磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖，且丁草胺濃度越高，抑制作用越明顯。

2.6 丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響

從圖6可以看出，丁草胺濃度不同，對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的影響也不同?？v觀整個(gè)丁草胺處理時(shí)期，50%推薦劑量B15的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量在施藥7 d時(shí)有一小幅增加，之后基本保持穩(wěn)定，但4次取樣均未與CK達(dá)到顯著差異；100%推薦劑量B30和500%推薦劑量 B150的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量則始終與CK保持顯著差異，B30的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量在4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)基本保持恒定，B150則在施藥7和15 d時(shí)較低，分別比CK低60.7%和58.1%，到施藥30 d后達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀況。可見高產(chǎn)水稻土的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量與丁草胺的施用濃度密切相關(guān)，低濃度對(duì)硅酸鹽細(xì)菌影響不明顯，中高濃度對(duì)硅酸鹽細(xì)菌有抑制作用，且在丁草胺達(dá)到半衰期之前，濃度越高，抑制作用越明顯。

3 討論

由于丁草胺應(yīng)用范圍廣、使用量大，對(duì)土壤環(huán)境的影響較為直接，目前國(guó)內(nèi)外也有一些關(guān)于施用丁草胺后對(duì)土壤微生物區(qū)系影響的相關(guān)報(bào)道。在三大微生物數(shù)量方面，Min發(fā)現(xiàn)施用不同濃度丁草胺后，土壤放線菌數(shù)量顯著下降，細(xì)菌和真菌數(shù)量上升，22 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)丁草胺可導(dǎo)致真菌生長(zhǎng)遲滯（Min等, 2001）；單敏發(fā)現(xiàn)10 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下細(xì)菌、真菌和放線菌均受到抑制，2～4 mg·kg-1丁草胺對(duì)放線菌生長(zhǎng)有刺激作用（單敏等，2005）；趙蘭則發(fā)現(xiàn)低濃度對(duì)細(xì)菌有刺激作用，20 mg·kg-1高質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)放線菌有抑制作用，各濃度處理對(duì)真菌均表現(xiàn)為先抑制后刺激（趙蘭和黎華壽，2008）。在功能微生物數(shù)量方面，施用丁草胺可影響解磷微生物的生長(zhǎng)和活性（Dennath等, 2002），刺激水解發(fā)酵性細(xì)菌（Min等, 2001）、硫酸鹽還原細(xì)菌（Min等, 2001；陳中云等，2004）和反硝化細(xì)菌（Min等, 2001；陳中云等，2003a）生長(zhǎng)，抑制產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌（Min等, 2001）生長(zhǎng)，對(duì)甲烷產(chǎn)生菌的影響則與濃度相關(guān)，低濃度加速生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)，施藥7 d時(shí)抑制作用最大（Min等, 2001；陳中云等，2003b）。此外，研究者還通過(guò)乙炔還原法和液體培養(yǎng)最大或然計(jì)數(shù)法測(cè)定了水稻土中厭氧固氮菌和反硝化細(xì)菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)施用丁草胺后可加強(qiáng)微生物群落的固氮作用（Min等, 2001；Suseela, 2001；Chen等, 2009）和反硝化作用（Min等, 2001）。雖然研究者采用不同濃度組合進(jìn)行模擬試驗(yàn)，但結(jié)果仍有共性，綜合前人和本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，施用丁草胺會(huì)對(duì)土壤微生物區(qū)系造成影響，影響方向和影響程度與微生物種類和丁草胺濃度密切相關(guān)。

平板培養(yǎng)法是微生物研究中最經(jīng)典也最行之有效的方法之一，其優(yōu)勢(shì)在于可獲得微生物純菌株，并可計(jì)算自然樣品中可培養(yǎng)的活的微生物數(shù)目，在研究微生物種群結(jié)構(gòu)、生理生化特性、遺傳育種以及開發(fā)利用微生物資源方面具有不可取代的重要地位。因此，即使在分子生物學(xué)手段日新月異的今天，對(duì)自然界微生物的研究依舊離不開傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)手段。但同時(shí)必須指出，平板培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件系人為限定，常會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)條件的原因造成某些微生物的富集生長(zhǎng)和另一些微生物的缺失，在一定程度上影響著對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，且自然界能夠被培養(yǎng)的微生物一般只占微生物總量的1%～10%（Daniel, 2005；Torsvik和Ovreas,2002），絕大數(shù)微生物可以在自然環(huán)境中存在，卻無(wú)法在人工條件下生長(zhǎng)（張洪勛等，2003），因此還需結(jié)合其它生物技術(shù)方能客觀而全面地反映微生物群落的真實(shí)信息（孔維棟等，2004）。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)分析模擬條件下丁草胺污染對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響，得到以下結(jié)論。

1）中高濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌具有先刺激生長(zhǎng)、后抑制活性的作用，低濃度丁草胺對(duì)好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖影響不明顯。

2）中高濃度丁草胺對(duì)放線菌有刺激作用，且濃度越高，刺激作用表現(xiàn)得越快越明顯，低濃度丁草胺對(duì)放線菌則主要表現(xiàn)為抑制作用。

3）低濃度丁草胺對(duì)真菌的生長(zhǎng)和增殖基本沒有影響，中等濃度有先抑制后刺激的作用，高濃度丁草胺則始終表現(xiàn)為對(duì)真菌的抑制作用。

4）不同濃度處理丁草胺均能刺激自生固氮菌的數(shù)量顯著增加，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度開始表現(xiàn)出抑制作用。

5）不同濃度丁草胺均能抑制磷酸鹽溶解菌的生長(zhǎng)和增殖，且丁草胺濃度越高，抑制作用越明顯。

6）低濃度丁草胺對(duì)硅酸鹽細(xì)菌的數(shù)量影響不明顯，中高濃度則對(duì)其有抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯。

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