用DGGE 法初步解析茯磚茶渥堆 發(fā)酵過程中真菌群落的結(jié)構(gòu)

劉石泉，胡治遠(yuǎn)，趙運林*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽 413000)

茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，是黑茶家族中重要的一員[1]，具有降低人體類脂肪化合物、血脂[2–4]、血壓、血糖[5]、膽固醇[6]和抗腹瀉[7]、整腸胃[8]、抗氧化[9]等功效。茯磚茶發(fā)酵工序分為“前發(fā)酵”和“后發(fā)酵”兩部分。前發(fā)酵和后發(fā)酵在制茯磚茶行業(yè)一般被分別稱為“渥堆”與“發(fā)花”[10]。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為茯磚茶的獨特保健功效源于黑毛茶本身含有的功能成分，如茶多酚、茶多糖、茶氨酸等，但更多的學(xué)者認(rèn)為是源于黑毛茶 “渥堆”與“發(fā)花”過程中因微生物代謝而產(chǎn)生的生物活性成分[11–12]，認(rèn)為微生物作用是提升其內(nèi)在品質(zhì)的關(guān)鍵。對茯磚茶參與發(fā)酵微生物作用的研究主要集中在茯磚茶發(fā)花這一工藝環(huán)節(jié)[13]，而對渥堆過程中微生物的研究相對較少。用未經(jīng)渥堆或渥堆工藝控制不佳的茶葉加工的茯磚茶的成品品質(zhì)較差，湯色淺，滋味澀，香氣淡或有異味[14]。對茯磚茶渥堆過程中微生物的研究多采用梯度稀釋和平板培養(yǎng)計數(shù)法。這些方法存在一定的局限性[15]。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)常被用于對復(fù)雜環(huán)境中微生物種群進(jìn)行分析鑒定，具有可靠性強、重現(xiàn)率高等優(yōu)點，能檢測到群落中90%～99%的微生物物種[16–17]，在茯磚茶發(fā)花、發(fā)酵過程中能跟蹤微生物群落多樣性的動態(tài)變化[18–19]。筆者用DGGE技術(shù)研究渥堆過程中不同發(fā)酵時期黑毛茶真菌群落的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，以期為茯磚茶渥堆工藝的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 茯磚茶樣品

以湖南省高校黑茶發(fā)酵與關(guān)鍵技術(shù)控制產(chǎn)學(xué)研合作示范基地——湖南益陽茶廠有限公司茯磚茶渥堆生產(chǎn)線上分別經(jīng)過0、8、16、24、32、40、48 h 渥堆的一級黑毛茶葉為試驗樣品(分別編號為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7)，用上、中、下3 層分層獨立取樣后，經(jīng)四分法逐步縮分至500g左右，置－20℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

PCR引物FR1(5′–AICCATTCAATCGGTAIT –3′)、GC–FR1(5′–CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGG GGCGGGGGCGCGGGGGGAICCATTCAATCGGT AIT–3′)和FF390(5′–CGATAACGAACGAGACCT–3′)由北京美億美生物技術(shù)有限公司合成；擴增試劑均購自北京美億美生物技術(shù)有限公司；PCR 產(chǎn)物采用AXYGEN 公司的DNA Gel Extraction Kit純化回收；DGGE 目的條帶采用OMEGA 公司的Poly–Gel DNA Extraction Kit 回收；其他試劑為國產(chǎn)，分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備為PTC220 型PCR 儀(美國 BIO–RAD 公司)、Gel–Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio–Rad 公司)和DGGE–2401 變性梯度凝膠電泳儀(美國C.B.S.Scientific 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 真菌基因組的提取

用超聲波振蕩法[20]提取茶葉樣品中真菌的基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 樣品，于－20℃冰箱保存。

1.2.2 真菌18S rDNA 片段的PCR 擴增與回收

以基因組DNA 為模板，采用通用引物GC–FR1 (含GC夾，便于DGGE分離)和FF390擴增18S rDNA的高變區(qū)序列[21]。

PCR 擴增體系參照文獻(xiàn)[19]，將引物替換為GC– FR1(20 mmol/L，1 μL)和FF390(20 mmol/L，1 μL)。PCR 擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火45 s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物采用Axygen 公司的DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行純化回收。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

按照文獻(xiàn)[20]的方法，取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。

1.2.4 DGGE 凝膠條帶的回收測序

用滅菌手術(shù)刀切下待回收的DGGE 條帶，采用OMEGA 公司的Poly–Gel DNA Extraction Kit 回收目的條帶。

以2 μL 回收產(chǎn)物為模板，以FR1/FF390 為引物進(jìn)行PCR 擴增。PCR 擴增體系參照文獻(xiàn)[19]，將引物替換為FR1(20 mmol/L，1 μL)和FF390(20 mmol/L，1 μL)。PCR 擴增程序為94℃預(yù)變性4min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

將重新擴增的DNA 片段切膠回收、純化，連接到pMD18–T 載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，送華大基因公司進(jìn)行序列測定。每個回收條帶重復(fù)選取3個克隆。

1.2.5 真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析

采用Quantity one 軟件對每個茶葉樣品的電泳條帶數(shù)、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化，導(dǎo)出的結(jié)果用于多樣性分析和主成分分析。用香農(nóng)指數(shù)(Shannon– Wiener Index，H)、豐度(Richness，S)和均衡指數(shù)(Evenness，E)等指標(biāo)比較不同渥堆時期茶葉樣品中真菌的多樣性[22]，其算法如下：

其中：Pi是茶葉樣品中單一條帶的強度占該樣品所有條帶總強度的比率；N 為DGGE 圖譜單一泳道上所有條帶的豐度；Ni為第i 條帶的豐度；S 為某個茶葉樣品中所有條帶數(shù)目的總和。

采用CANOCO 排序軟件，根據(jù)不同樣品條帶亮度和位置的數(shù)值對真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行主成分分析。

測序結(jié)果采用DNAstar 和Cluster 軟件進(jìn)行序列分析。將所得正確長度的序列用Blast 法與基因庫中的序列進(jìn)行比對。下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。采用MEGA 軟件，用Neighbor–joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1 000。

將DGGE凝膠條帶分別回收、測序，在GenBank數(shù)據(jù)庫中使用Blast 程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的18S rDNA 序列。根據(jù)這些DGGE條帶所代表的微生物來判定茯磚茶不同渥堆階段的真菌群落組成。

用軟件MEGA5 對18S rDNA 的高變區(qū)序列和GenBank 中相關(guān)種屬代表菌株的18S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因組的DNA 提取結(jié)果

由圖1 可見，提取的DNA 大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2 000 kb，說明成功獲得了樣本W(wǎng)1～W7的真菌基因組DNA。

圖1 茶葉樣本中提取的真菌基因組DNA 的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Fig.1 Agarosegel electrophoresis of fungal DNA extracted from tea samples

2.2 真菌18S rDNA 的PCR 擴增結(jié)果

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了約390 bp的DNA 片段。該片段大小與預(yù)期DNA 片段的大小相符(圖2)。

圖2 茶葉樣本中真菌的18S rDNA PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Fig.2 Partial sequence of fungal 18S rDNA by PCR amplification agarosegel electrophoresis of tea samples

2.3 PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳結(jié)果

由圖3 可見，在黑毛茶渥堆過程中，18S rDNA 的高變區(qū)序列類型豐富。圖3 中從渥堆開始到渥堆結(jié)束的DGGE 條帶變化清晰地反映出整個渥堆過程真菌群落的動態(tài)發(fā)展變化過程。僅從優(yōu)勢菌的變化來看，渥堆24 h 前和24 h 后，優(yōu)勢菌帶型差別較為明顯：渥堆24 h 前有4 號優(yōu)勢條帶、17 號次優(yōu)勢條帶；在渥堆24 h 后，4 號、17 號2個染色較濃的條帶仍然維持，且在40 h 時增加了6 號和11號2 條染色較濃的次優(yōu)勢條帶；渥堆結(jié)束時6 號和11 號染色減弱。這說明隨著渥堆進(jìn)程的推進(jìn)，參與渥堆作用的真菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同。主成分分析結(jié)果(圖4)和不同渥堆階段進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖5)都表明，渥堆過程中真菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同，其原因主 要是渥堆的溫度、相對濕度等環(huán)境變化和微生物種間的相互促生、共生、競爭等，使渥堆開始出現(xiàn)的真菌在后續(xù)渥堆過程中出現(xiàn)適應(yīng)性生長，當(dāng)渥堆環(huán)境的改變有利于特定真菌適應(yīng)性生長時，該菌就有可能成為該渥堆時間段的優(yōu)勢種群，從而實現(xiàn)優(yōu)勢菌群的更替變化。

圖3 茯磚茶不同渥堆階段真菌18S rDNA–PCR 產(chǎn)物的DGGE 圖譜 Fig.3 DGGE chromatogram of fungi 18S rDNA–PCR products in different pile fermentation stages of Fuzhuan brick tea

圖4 茯磚茶不同渥堆發(fā)酵階段的主成分分析結(jié)果 Fig.4 PCA analysis in different pile fermentation stages of Fuzhuan brick tea

結(jié)合表1 中結(jié)果可以看出，多樣性指數(shù)在渥堆發(fā)酵全程中的變化較大，在渥堆前期(0～16 h)呈升高趨勢，在渥堆中期階段(＞16～24 h)略有降低，＞24 h 之后又繼續(xù)升高，在渥堆40 h 時升到最高(2.348)，而渥堆末期(＞40～48 h)仍然維持在較高水平。均勻性指數(shù)、豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)均呈升高、降低、升高、維持穩(wěn)定的變化趨勢，表明茯磚茶不同渥堆階段真菌群落的結(jié)構(gòu)差異較大，且隨渥堆時間的推移呈較有規(guī)律的變化。多樣性指數(shù)在渥堆前期呈升高趨勢的原因可能是渥堆開始時，隨著環(huán)境濕度、熱度等的變化，黑毛茶本身攜帶的大量真菌開始萌動，隨著渥堆時間的推移，適應(yīng)渥堆環(huán)境的真菌慢慢滋生，代謝逐漸活躍；在渥堆中期(24 h)略有降低的原因可能是渥堆溫度增加、濕度增大和堆內(nèi)微生物活動等導(dǎo)致渥堆的環(huán)境條件發(fā)生了改變，參與渥堆的真菌進(jìn)行優(yōu)勝劣汰的自然選擇，真菌群落結(jié)構(gòu)隨著渥堆環(huán)境的變化而不斷進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。

表1 茯磚茶不同渥堆發(fā)酵階段真菌群落的特征 Table1 Characteristics of fungi community in different pile fermentation stages of Fuzhuan brick tea

圖5 茯磚茶不同渥堆發(fā)酵階段的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.5 Phylogenetic tree in different pile fermentation stages of Fuzhuan brick tea

2.4 DGGE 凝膠條帶的回收測序及序列分析

由表2 中DGGE 凝膠條帶回收序列比對分析結(jié)果和圖6 中真菌的18S rDNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，在茯磚茶渥堆發(fā)酵過程中存在的真菌包括好干性酵母菌 (Wallemia sebi) 、假絲酵母菌(Candida sp.)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、路德酵母屬(Lodderomyces sp.)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、隱球酵母(Cryptococcus sp.)、牧草紅酵母(Rhodotorulagraminis)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、白地霉(Galactomycesgeotrichum)、安大略假單胞菌(Candida ontarioensis)、真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis)、斜臥青霉(Penicillium decumbens)、曲霉(Aspergillus penicillioides)，其中屬于子囊菌門的有22 株，屬于擔(dān)子菌門的有7 株，屬于毛霉亞門的有2 株。

表2 DGGE 凝膠條帶回收序列分析結(jié)果 Table 2 Analysis results of DGGEgel bands recovery sequences

由圖3 中的DGGE 條帶可知，在整個渥堆過程中存在有4 號優(yōu)勢帶(路德酵母和漢遜德巴利酵母)和17 號次優(yōu)勢帶(阿姆斯特丹散囊菌)。2個染色一直較濃的條帶對應(yīng)的真菌為整個渥堆過程的優(yōu)勢菌和次優(yōu)勢菌。在渥堆32～40 h 時出現(xiàn)了6 號(好干性酵母)和11 號(漢遜德巴利酵母和釀酒酵母)2個染色較濃的次優(yōu)勢條帶，且這2個條帶在渥堆48 h 時減弱。這可能是由渥堆中后期環(huán)境的改變所致；一方面微生物代謝釋放熱量導(dǎo)致堆溫升高，另一方面微生物釋放的代謝產(chǎn)物使得生存環(huán)境的pH、相對濕度、滲透勢、含氧量等發(fā)生改變，導(dǎo)致特定種類酵母菌(6 號和11 號)的營養(yǎng)體在渥堆末期停止生長，甚至死亡。這一結(jié)果說明，隨著渥堆時間的推進(jìn)，參與渥堆作用酵母的種類和各類的數(shù)量發(fā)生著較大的改變。

圖6 茯磚茶渥堆過程中26個真菌的18S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.6 Phylogenetic tree of the 26 strain fungi 18S rDNA sequence during the pile fermentation process of Fuzhuan brick tea

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同渥堆時間段真菌群落結(jié)構(gòu)以渥堆24 h 為分界點，分界點前后真菌群落結(jié)構(gòu)的變化較大。真菌群落多樣性指數(shù)在渥堆0～16 h 呈升高趨勢，＞16～24 h 略有降低，＞24 h 之后又繼續(xù)升高，在渥堆后期(40 h 時)升到最高(2.348)，而渥堆末期(＞40～48 h)仍然維持在較高水平。隨著渥堆時間的推移，茶堆內(nèi)部溫度、相對濕度的變化和茶堆內(nèi)部微生物的活動及其對堆內(nèi)微環(huán)境的影響，加上人為翻堆等環(huán)境控制因素，導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而有助于形成茯磚茶特有的品質(zhì)。茯磚茶渥堆優(yōu)勢菌的出現(xiàn)時間、種類、多少、背景(如溫度、濕度、協(xié)同菌等)等有望作為人為控制渥堆過程的依據(jù)。

試驗結(jié)果表明，茯磚茶渥堆過程中的真菌類型十分豐富。18S rDNA 序列比對獲得的最相似菌株分別屬于子囊菌門、擔(dān)子菌門、毛霉亞門等，其中一部分真菌，如路德酵母屬、斜臥青霉、阿姆斯特丹散囊菌在黑茶渥堆過程中較為常見(已于文獻(xiàn)[24]中報道)，而另一部分真菌，如安大略假單胞菌、牧草紅酵母等在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中都未曾檢出過。

試驗中檢出的微生物種群中以酵母菌的種類最為豐富。本研究中發(fā)現(xiàn)有好干性酵母、假絲酵母菌、熱帶假絲酵母、路德酵母屬、漢遜德巴利酵母、畢赤酵母屬、釀酒酵母、隱球酵母、牧草紅酵母等9種酵母，其中路德酵母屬和漢遜德巴利酵母存在于渥堆的整個過程，渥堆至40 h 時，又增加了好干性酵母和漢遜德巴利酵母、釀酒酵母2個次優(yōu)勢酵母菌條帶；同源性比對也發(fā)現(xiàn)了3 株好干性酵母，其中好干性酵母在渥堆后期成為了次優(yōu)勢菌，說明茯磚茶渥堆過程中酵母存在多種類型的生態(tài)適應(yīng)種群，對渥堆質(zhì)量起著極為重要的作用。

試驗結(jié)果表明，阿姆斯特丹散囊菌存在多種類型的生態(tài)適應(yīng)種群。在發(fā)花過程中大量存在的微生物阿姆斯特丹散囊菌(次優(yōu)勢菌條帶17號)在渥堆開始時就較多，并且一直維持到渥堆結(jié)束，至于阿姆斯特丹散囊菌(優(yōu)勢菌條帶17 號)是否與茯磚茶發(fā)花、發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌為同一種群，還有待確證。本研究中發(fā)現(xiàn)渥堆全過程中有7 株阿姆斯特丹散囊菌，其中除17 號阿姆斯特丹散囊菌在渥堆全過程中為次優(yōu)勢菌外，其余6 株在渥堆過程中的亮度較為一致，能與阿姆斯特丹散囊菌(17 號)共存。渥堆過程中7 株阿姆斯特丹散囊菌的存在說明了阿姆斯特丹散囊菌種群內(nèi)有較大的差異。這與全國各地關(guān)于茯磚茶中優(yōu)勢菌阿姆斯特丹散囊菌差異的研究結(jié)果[15]是一致的。

茯磚茶對降低高血壓、肥胖、糖尿病等高發(fā)“富貴病”具有較明顯的效果，所以，其市場開發(fā)前景較為廣闊。根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)的類型及其作用，實現(xiàn)精控發(fā)酵，充分發(fā)揮發(fā)酵微生物的協(xié)同作用，使生物轉(zhuǎn)化作用朝著有益于改善茯磚茶品質(zhì)、提高茯磚茶活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的方向進(jìn)行將成為今后研究的重點。

[1] 陳宗懋，楊亞軍．中國茶經(jīng)[M]．上海：上海文化出版社，2011：313–317．

[2] 傅冬和，劉仲華，黃建安，等．茯磚茶降脂功能成分研究[J]．茶葉科學(xué)，2012，32(3)：217–223．

[3] 彭曉赟，趙運林，何小書，等．茯磚茶茶葉品質(zhì)和保健功能的研究概況[J]．湖南城市學(xué)院學(xué)報，2011，20(4)：45–48．

[4] Martins F，Noso T M，Porto V B，et al．Maté tea inhibits in vitro pancreatic lipase activity and has hypolipidemic effect on high-fat diet-induced obese mice[J]．Obesity，2010，18(1)：42–47．

[5] Kang L，Chen X，Sebastian B M，et al．Chronic ethanol and triglyceride turnover in white adipose tissue in rats inhibition of the anti-lipolytic action of insulin after chronic ethanol contributes to increased triglyceride degradation[J]．Journal of Biological Chemistry，2007，282(39)：28465–28473．

[6] Lee S M，Kim C W，Kim J K，et al．GCG-rich tea catechins are effective in lowering cholesterol and triglyceride concentrations in hyperlipidemic rats [J]. Lipids，2008，43(5)：419–429．

[7] 曾婷玉，李恒彪，曾斌，等．茯磚茶對腸道4 種常住微生物的影響[J] 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，39(4)：387–392．

[8] 劉平，李宗軍，許愛清．茯磚茶水提物對大腸桿菌感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，37(5)：537–539，566．

[9] 丁金祥，黃昀，李勇，等．茯磚茶抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝研究[J]．食品研究與開發(fā)，2013，34(16)：12–14，35．

[10] 蔡正安，唐和平．湖南黑茶：中國古絲綢之路的神秘之茶[M]．長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2006：12–35．

[11] 傅冬和，劉仲華，黃建安，等．茯磚茶加工過程中主要化學(xué)成分的變化[J]．食品科學(xué)，2008，29(2)：64–67．

[12] 李佳蓮，胡博涵，劉素純，等．微生物與茯磚茶品質(zhì)形成研究進(jìn)展[J]．食品工藝科技，2010(9)：406–408，413．

[13] 文杰宇．茯磚茶發(fā)花過程中微生物多樣性研究[D]．長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：2–3．

[14] 劉石泉，趙運林，胡治遠(yuǎn)，等．不同渥堆條件對茯磚茶品質(zhì)的影響研究[J]．食品工藝科技，2012(22)：256–259．

[15] 胡治遠(yuǎn)，劉素純，趙運林，等．茯磚茶生產(chǎn)過程中微生物動態(tài)變化及優(yōu)勢菌鑒定[J]．食品科學(xué)，2012(19)：244–248．

[16] Liu Wenjun，Bao Qiuhua，Qing Manjun．Isolation and identification of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE analysis[J]．Microbiological Research，2012，167(2)：243–249．

[17] 許愛清，李宗軍，王遠(yuǎn)亮，等．應(yīng)用PCR–DGGE 技術(shù)檢測發(fā)酵食品和飼料中真菌菌群[J]．食品科學(xué)，2010，31(7)：317–322．

[18] Xu Aiqing，Wang Yuanliang，Wen Jieyu，et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan bricktea[J]．International Journal of Food Microbiology，2011，146(1)：14–22．

[19] 劉石泉，胡治遠(yuǎn)，趙運林．基于DGGE 技術(shù)的茯磚茶發(fā)花過程細(xì)菌群變化分析[J]．生態(tài)學(xué)報，2014，34(11)：3007–3015．

[20] 孫婷婷，趙明，李亞莉，等．普洱茶發(fā)酵樣品細(xì)菌和真菌DNA 同時提取方法研究[J]．中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(15)：249–253．

[21] Li Anying，Yu Wei，Sun Zhenjun．Analysis of bacterial and fungal community structure in replant strawberry rhizosphere soil with denaturinggradientgel electro- phoresis[J]．African Journal of Biotechnology，2012，49(11)：10962–10969．

[22] 錢迎倩，馬克平．生物多樣性研究的原理與方法[M]．北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1994：141–165．

[23] Koichiro Tamura，Daniel Peterson，Nicholas Peterson et al. MEGA5：molecular evolutionarygenetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]．Mol Biol Evol，2011，28(10)：2731–2739．

[24] 劉石泉，雷存喜，趙運林．黑茶中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法思考[J]．茶葉科學(xué)技術(shù)，2010(1)：9–11．