納米氧化鋁致大鼠肺部急性損傷研究

馬繼軒, 陳 艷, 蘇德奇, 喬佩環(huán), 張林媛, 余 再, 唐仕川, 馬 龍, 常 兵

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所， 北京 100050；3北京市勞動保護科學(xué)研究所， 北京 100054)

納米材料是指至少一維空間的粒徑≤100 nm的材料。當(dāng)物質(zhì)細分到納米尺度時，其理化性質(zhì)會發(fā)生很大變化，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)等，從而導(dǎo)致它們對生物體的作用可能與常規(guī)物質(zhì)有很大的不同[1]。納米氧化鋁材料作為一種新型材料，常用于電子、化學(xué)化工、航天、醫(yī)藥、催化劑等領(lǐng)域。納米氧化鋁已廣泛應(yīng)用到人們的日常生活中，因此其對機體可能產(chǎn)生的潛在影響不容忽視[2]。本研究選用在納米氧化鋁作業(yè)場所空氣中檢測到的顆粒的平均濃度的40、200、1 000 倍，對Wistar大鼠肺部進行滴注染毒，研究納米氧化鋁顆粒對肺部組織的毒性效應(yīng)，為納米氧化鋁安全生產(chǎn)評估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑、材料與儀器Fresco低溫冷凍離心機(Thermo)，722分光光度計， SB-5200DTN超聲清洗儀，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),乙醚(分析純，上海實驗試劑公司)，瑞士吉姆薩染液(南京建成生物工程研究所)。納米氧化鋁粉末由蘇州華微特粉體技術(shù)有限公司提供，透射電鏡下納米氧化鋁顆粒中狀態(tài)如圖1所示，X射線衍射儀結(jié)果顯示，此納米氧化鋁為γ相(圖2)。BET比表面積儀測得納米氧化鋁的比表面積為200.4 m2/g；激光粒度儀檢測溶于生理鹽水中的納米氧化鋁顆粒平均粒徑為90 nm，說明納米顆粒在生理鹽水中發(fā)生了一定程度的團聚。

圖1 透射電鏡下的納米氧化鋁顆粒

圖2 納米氧化鋁X射線衍射圖譜

1.2動物的飼養(yǎng)及染毒健康雄性SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心動物實驗室。動物房溫度保持在22～24℃，相對濕度為40%～60%，明暗周期為12 h∶12 h。適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后，將48只大鼠按照隨機分組原則分為對照組(生理鹽水組)、納米氧化鋁低劑量組(14 mg/kg)、納米氧化鋁中劑量組(70 mg/kg組)、納米氧化鋁高劑量組(350 mg/kg組)4組，每組12只。采用單次氣管滴注法進行染毒，并連續(xù)觀察至28 d。

1.3劑量的確定(換算成標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài))[3]

(公式1)

空氣中納米顆粒濃度(換算成標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài))：

(公式2)

個人一個工作班次的空氣納米顆粒暴露量：

(公式3)

式中, Cd為空氣粉塵濃度(mg/m3);CN為空氣納米的濃度(μg/m3);M為空氣納米的暴露量(mg);W為濾膜上粉塵的質(zhì)量(mg);m為采樣濾膜上納米的質(zhì)量(μg);T為現(xiàn)場溫度(℃);Pt為現(xiàn)場大氣壓(kPa);V為采樣開始和采樣結(jié)束時采樣泵的平均流速(mL/min);t為采樣時間(min) 。此處計算個人空氣納米暴露量時假設(shè)受試者平均每天吸入的空氣量為15 m3,工作暴露時間為8 h。隨后將個人暴露值擴大的40、200、1 000倍作為本次實驗濃度劑量。

根據(jù)之前的納米生產(chǎn)現(xiàn)場粉塵暴露值可知，納米氧化鋁現(xiàn)場暴露數(shù)量濃度為80 000個/cm2。由此可推算得知，染毒劑量分別為14、70、350 mg/kg。

1.4實驗方法

1.4.1 染毒懸液的配制及穩(wěn)定性分析 將100 μg/mL的納米氧化鋁懸液超聲不同時間后，用激光粒度儀檢測懸濁液中顆粒的粒徑分布，確定納米氧化鋁懸液分散性。隨后將超聲后的納米氧化鋁懸液(平均粒徑<100 nm)靜置不同時間點后，通過激光粒度儀計算靜置后每個時間點懸液的平均粒徑。

1.4.2 氣管滴注染毒 本實驗采用非暴露式氣管滴注法染毒，按0.2 mL/100 g體質(zhì)量進行一次性滴注染毒。染毒前先將大鼠用適量乙醚麻醉后，迅速固定在自制傾斜臺架上，將耳鏡放入口中，其下端正好處于大鼠會厭部，使氣管充分暴露，其身體自然下垂，然后將肺滴注針裝上注射器，通過耳鏡在會厭部輕輕插入氣管，再將配制好的納米氧化鋁懸浮液注入大鼠氣管內(nèi)，灌注完畢后抽出針頭，輕輕拍大鼠胸部完成整個染毒過程。

1.4.3 肺部灌洗液(BALF)的收集 染毒后3、28 d，腹主動脈放血處死大鼠，打開胸腔，暴露氣管，剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，用線繩結(jié)扎固定；止血鉗夾閉左主支氣管，緩慢注入生理鹽水(37℃)5 mL，緩慢抽出灌洗液，邊操作邊輕輕按摩胸部以增加灌洗液的洗出率，反復(fù)灌洗3～5次；將提取的肺灌洗液經(jīng)4℃、1 500 r/min離心10 min，沉淀細胞的一部分用生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，進行細胞涂片。瑞士-吉姆薩染色后進行白細胞分類計數(shù)，計數(shù)200個細胞，計算BALF中各類細胞的百分比；同時將上清液于8 000 r/min離心20 min,取上清，保存于4℃待測各項生化指標(biāo)。

1.4.4 肺部灌洗液中的生化指標(biāo)檢測 采用標(biāo)準(zhǔn)比色法檢測灌洗液中的生化指標(biāo),包括總蛋白(TP)含量及堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)活性測定。試劑盒由南京建成生物制品研究所提供，按照說明書操作。

1.4.5 肺組織相關(guān)指標(biāo)檢測 染毒后3、28 d，腹主動脈放血處死大鼠，取右肺組織凍存(-80℃)，待測。采用標(biāo)準(zhǔn)比色法檢測MDA含量及SOD、CAT和GSH-Px的活力。試劑盒由南京建成生物制品研究所提供，按照說明書操作。

1.4.6 肺組織病理學(xué)特征觀察 取大鼠未灌洗的左肺組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片和H-E染色，觀察病理變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析用Excel2007建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS13.0進行單因素方差分析，方差齊時任意兩組間比較采用LSD檢驗。方差不齊時任意兩組間比較采用Dunnett’f檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1一般情況實驗中未發(fā)現(xiàn)小鼠有呼吸困難、進食減少等異常等現(xiàn)象，無死亡。實驗期間各劑量組小鼠體質(zhì)量變化與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2納米氧化鋁懸液分散性及穩(wěn)定性分析將納米氧化鋁懸液溶于生理鹽水配制成濃度為100 μg/mL的懸液后將其超聲分散30 min，觀察得知懸液的平均粒徑<100 nm，并且繼續(xù)超聲對平均粒徑的改變無明顯影響(圖3)。納米懸液超聲30 min后靜置，隨著靜置時間的增加，粒子開始團聚，納米氧化鋁懸液的平均粒徑也有所增加，并且在靜置15 min后平均粒徑>100 nm(圖4)。

2.3肺部灌洗液(BALF)中生化指標(biāo)測定結(jié)果染毒后3、28 d，低、中、高劑量組中的乳酸脫氫酶(LDH)明顯升高(P<0.05)。染毒后3 d，低、中、高劑量組的堿性磷酸酶(AKP)活性均較生理鹽水組明顯增加(P<0.05)，中、高劑量組總蛋白(TP)含量較生理鹽水組明顯增加(P<0.05)；染毒后28 d，中、高劑量組的堿性磷酸酶(AKP)活性較生理鹽水組明顯增加(P<0.05)，低、中、高劑量組總蛋白(TP)含量較生理鹽水組明顯增加(P<0.05)；染毒后3、28 d，各劑量組中酸性磷酸酶(ACP)活性均較生理鹽水組明顯升高(P<0.05),見表1。

圖3 納米懸液超聲時間與粒徑變化

圖4 納米懸液靜置時間與粒徑變化

處理組TP/(g/L)3 d28 dLDH/(U/L)3 d28 dAKP/(U/100 mL)3 d28 dACP/(U/100 mL)3 d28 d生理鹽水組0.16±0.030.20±0.05899.27±109.54947.84±213.431.34±0.082.52±0.911.18±0.631.18±0.71低劑量組0.18±0.080.26±0.12?1 443.72±231.42?1 521.44±145.64?2.67±1.33?2.31±0.421.92±1.27?2.14±0.81?中劑量組0.51±0.11?0.48±0.18?2 210.59±313.87?1 978.63±215.96?6.89±2.87?5.52±1.27?4.36±1.08?3.71±2.07?高劑量組0.58±0.06?0.41±0.22?2 824.05±296.58?2 485.60±445.12?7.71±2.19?5.92±2.33?5.15±1.48?5.88±2.32?

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05。

2.4灌洗液白細胞分類計數(shù)結(jié)果染毒后3 d，中、高劑量組白細胞總數(shù)和中性粒細胞的比例均較生理鹽水組明顯增加(P<0.05)，巨噬細胞所占的比例明顯降低(P<0.05)。染毒后28 d，中、高劑量組的白細胞總數(shù)和中性粒細胞所占的比例仍高于生理鹽水組，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組中的白細胞總數(shù)較3 d高劑量組有所下降，中性粒所占比例也有所下降，見表2、3。

表2 一次性肺部滴注3 d后大鼠肺部灌洗液白細胞計數(shù)及分類

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05。

表3 一次性肺部滴注28 d后大鼠肺部灌洗液白細胞計數(shù)及分類類

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05。

2.5肺部組織氧化應(yīng)激損傷結(jié)果一次性滴注3 d后，與生理鹽水組相比，中、高劑量組丙二醛(MDA)含量明顯增加(P<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著降低(P<0.05)；與生理鹽水組相比，高劑量組谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；一次性滴注28 d后，與生理鹽水組相比，高劑量組丙二醛(MDA)含量顯著增加(P<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性顯著降低(P<0.05)；染毒后3、28 d，各組過氧化氫酶(CAT)活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 染毒3、28 d后各組MDA、SOD、CAT及GSH-Px含量

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05。

2.6肺組織病理觀察染毒后3、28 d，生理鹽水組肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性浸潤(圖3a)；染毒后3 d，低劑量組中出現(xiàn)了肺泡毛細血管擴張，有少量出血，支氣管細胞周圍有少量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔受壓(圖3b)；中劑量組部分肺泡腔中有水腫液，同時有纖維素的滲出，間質(zhì)有炎性細胞浸潤。肺泡上皮細胞脫落，出現(xiàn)代償性肺氣腫，部分肺泡受壓(圖3c)；高劑量組中間質(zhì)細胞炎性浸潤，部分肺泡腔有粉紅色液狀物，部分肺泡受壓，出現(xiàn)肺不張(圖3d)。染毒后28 d，生理鹽水組結(jié)構(gòu)正常(圖3e)低劑量組炎性細胞滲出，肺泡壁增厚，部分斷裂形成肺氣腫(圖3f)；中、高劑量組與染毒后3 d時相比，均無特殊改變(圖3g、圖3h)。隨劑量的增加，各種病理改變更加明顯。

染毒后3 d, a: 生理鹽水組

b： 低劑量組

c： 中劑量組

d：高劑量組

染毒后28 d, e: 生理鹽水組

f: 低劑量組

g： 中劑量組

h： 高劑量組

圖3肺部組織病理圖片(HE×200)

3 討論

大量研究表明，納米顆粒物能引起急性肺部損傷，釋放炎癥因子[4-6]。本研究顯示，在滴注染毒后3 d，各個劑量組病理結(jié)果相對于生理鹽水組有明顯改變，均出現(xiàn)了間質(zhì)炎性細胞的浸潤，中、高劑量組病理改變明顯，部分肺泡腔受壓，形成了代償性肺氣腫；在滴注染毒后28 d，各個劑量組與生理鹽水組對比，同樣還有炎性細胞的浸潤。從病理結(jié)果可以看出，納米氧化鋁的確對肺部組織產(chǎn)生了急性損傷。

BALF中的白細胞分類計數(shù)的變化基本可以反映肺部組織的炎癥反應(yīng)，其中中性粒細胞浸潤是導(dǎo)致肺部組織損傷發(fā)生發(fā)展的重要原因[7],中性粒細胞增多是肺泡炎癥的標(biāo)志[8]。本研究顯示，染毒后3 d中性粒細胞比例增高，并且在染毒后28 d，比例仍然有顯著增加?？赡艿脑蚴羌{米氧化鋁顆粒進入肺泡腔，造成肺泡上皮細胞和毛細血管上皮細胞的損傷，從而使巨噬細胞活化，導(dǎo)致中性粒細胞的大量滲出。而造成肺組織炎癥反應(yīng)持續(xù)到28 d，可能是一次性大劑量染毒后，納米顆粒削弱了巨噬細胞的移動能力，從而導(dǎo)致納米顆粒在肺組織中局部儲留，繼續(xù)造成肺部炎癥損傷。從BALF的白細胞分類計數(shù)中可以觀察到各個染毒劑量組巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞均較生理鹽水組有明顯改變。這與Gilmour等[9]和Nemmar等[10]研究的結(jié)果相符。

BALF中含有肺的游離細胞，從肺細胞分泌和滲出以及從血管滲出的各種生化成分，從而肺灌洗液成分的變化可定量、迅速地反映肺對各種吸入毒物的反應(yīng)和肺受損的程度[11]。正常動物BALF中只含有少量的蛋白和低水平的酶活性。但當(dāng)呼吸系統(tǒng)表皮或內(nèi)皮細胞膜損傷時，導(dǎo)致血清流入呼吸道蛋白(TP)增加[11]。本研究結(jié)果顯示，在滴注染毒后3 d和28 d，中、高劑量組較生理鹽水組總蛋白含量(TP)均有顯著升高。說明在滴入染毒后，納米氧化鋁對肺泡產(chǎn)生了直接的損傷，導(dǎo)致肺部的結(jié)構(gòu)在短時間內(nèi)遭到破壞，肺泡受損，細胞中的血漿大量滲出，導(dǎo)致BALF中的總蛋白(TP)含量升高；BALF中LDH在肺組織中的含量較豐富，主要源自于肺上皮細胞、中性粒細胞和肺巨噬細胞。LDH活力增加是肺細胞生物膜通透性或結(jié)構(gòu)損傷的重要標(biāo)志。當(dāng)肺臟受損時，LDH會大量釋放，導(dǎo)致細胞外液中活力增加[13]。AKP主要由肺泡Ⅱ型細胞產(chǎn)生，其活性水平提示了肺泡Ⅱ型細胞和上皮細胞膜損傷[14]；ACP是溶酶體酶，巨噬細胞的溶酶體中富含ACP，當(dāng)顆粒物進入肺部組織時，肺中巨噬細胞受到刺激，巨噬細胞吞噬納米顆粒，使溶酶體數(shù)量增加、吞噬活躍。巨噬細胞死亡時，溶酶體破裂，ACP可大量釋放至細胞外，使細胞外液中ACP活力增加，肺灌洗液中ACP活力的增加可以反映肺吞噬細胞活力加強或結(jié)構(gòu)受損。因此，測定BALF中LDH及AKP、ACP的活力能反映納米氧化鋁的細胞毒性。本研究顯示，染毒后3 d和28 d，各染毒組LDH、ACP、AKP的活性均較生理鹽水組升高，說明一次性灌注后，納米顆粒引起了肺部的急性炎癥反應(yīng)，造成了肺泡腔內(nèi)滲出物增多，肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞受損，肺泡上皮-毛細血管屏障被破壞，表明納米氧化鋁對大鼠的肺實質(zhì)和膜性組織具有毒性作用。

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。對于納米材料對大鼠體內(nèi)產(chǎn)生毒性研究，一般主要認為納米材料進入體內(nèi)后引起體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷[15]。其中MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量可直接最有效地反映出組織中氧化損傷的指標(biāo)[16]。而在機體內(nèi)，存在一類抗氧化酶類物質(zhì)，如SOD、CAT、GSH-Px等，其主要功能是有效地抑制自由基的氧化損傷。SOD作為機體內(nèi)主要清除氧自由基的抗氧化酶，其活性可直接反映機體內(nèi)抗氧化反應(yīng)的改變；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化物分解的酶，其可特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對氫過氧化物的還原反應(yīng)。一般認為它在細胞內(nèi)能消除有害的過氧化代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，從而起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[17]。本研究結(jié)果表明，在染毒后3 d和28 d時，肺部組織中的MDA含量均較生理鹽水組升高。染毒后3 d，中、高劑量組SOD的活性下降，染毒后3 d和28 d時，高劑量組肺部組織中的GSH-Px的活性與生理鹽水組相比顯著降低。說明當(dāng)暴露于納米氧化鋁時，會導(dǎo)致過量ROS生成，體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)無法清除完全，從而打破機體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，引起大鼠肺部氧化損傷，一定劑量的納米氧化鋁可以引起肺部組織產(chǎn)生過多的自由基，導(dǎo)致肺部組織氧化損傷。從而引起肺部組織細胞損傷。

綜上所述，本研究顯示一次性納米氧化鋁的急性染毒可以引起大鼠肺部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。并且一次性滴注后，納米顆粒在肺部中仍有儲留，對肺部繼續(xù)造成損傷。關(guān)于納米氧化鋁對于機體損傷機制仍需要進一步探討。

參考文獻：

[1] Campagnolo L, Massimiani M, Palmieri G, et al. Biodistribution and toxicity of pegylated single wall carbon nanotubes in pregnant mice[J]. Part Fibre Toxicol,2013,10(1):21.

[2] Donaldson K, Poland CA, Murphy FA, et al. Pulmonary toxicity of carbon nanotubes and asbestos similarities and differences[J]. Adv Drug Deliv Rev,2013,65(15):2078-2086.

[3] 邢小茹 ,吳國平,王春利,等. 硼作業(yè)工人的空氣粉塵暴露與硼暴露測量與評價[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測,2005，21(3)：50-53.

[4] Costa DL, Lehmann JR, Winsett D, et al. Comparative pulmonary toxicological assessment of oil combustion particles following inhalation or instillation exposure[J]. Toxicol Sci,2006,91(1):237-246.

[5] 趙曉紅，劉紅，金昱，等. 大氣可吸入顆粒物對大鼠氣道的致炎癥作用研究[J]. 中國公共衛(wèi)生,2011,19(1):17-19.

[6] 賈玉巧，趙曉紅，郭新彪. 大氣顆粒物PM10和PM2.5對人肺成纖維細胞及其炎性因子分泌的影響[J]. 環(huán)境與健康雜志,2011,28(3):206-208.

[7] Weinacker AB, Vaszar LT. Acute respiratory distress syndrome: physiology and new management strategies[J]. Annu Rev Med,2013,52:221-237.

[8] Federici G, Shaw BJ, Handy RD. Toxicity of titanium dioxide nanoparticles to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): gill injury, oxidative stress, and other physiological effects[J]. Aquat Toxicol,2012,84(4):415-430.

[9] Gilmour PS, Ziesenis A, Morrison ER, et al. Pulmonary and systemic effects of short-term inhalation exposure to ultrafine carbon black particles[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2004,195(1):35-44.

[10] Nemmar A, Hoylaerts MF, Hoet PH, et al. Size effect of intratracheally instilled particles on pulmonary inflammation and vascular thrombosis[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2003,186(1):38-45.

[11] 闞海東，陳秉衡. 我國大氣顆粒物暴露與人群健康效應(yīng)的關(guān)系[J]. 環(huán)境與健康雜志,2002,19(6):422-424.

[12] Lee YC, Hogg R, Rannels DE. Extracellular matrix synthesis by coal dust-exposed type II epithelial cells[J]. Am J Physiol,2008,267(4 Pt 1):L365-L374.

[13] Bajpai R, Waseem M, Gupta GS, et al. Ranking toxicity of industrial dusts by bronchoalveolar lavage fluid analysis[J]. Toxicology,2012,73(2):161-167.

[14] Punithavathi D, Venkatesan N, Babu M. Curcumin inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Br J Pharmacol,2011,131(2):169-172.

[15] De Angelis I, Barone F, Zijno A, et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells[J]. Nanotoxicology,2013,7(8):1361-1372.

[16] Kowalczuk K, Stryjecka-Zimmer M. The influence of oxidative stress on the level of malondialdehyde (MDA) in different areas of the rabbit brain[J]. Ann Univ Mariae Curie Sklodowska Med,2002,57(2):160-164.

[17] Vicente E, Boer M, Netto C, et al. Hippocampal antioxidant system in neonates from methylmercury-intoxicated rats[J]. Neurotoxicol Teratol,2010,26(6):817-823.