IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴殺滅效果及周圍神經損傷的實驗研究

徐萬龍， 徐江波， 孫俊剛， 周文正， 趙喜濱， 王 浩， 袁 宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科， 烏魯木齊 830001)

棘球蚴病又稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲寄生在人畜之間相互傳染的寄生蟲病，嚴重危害全球人類的健康[1]。當棘球絳蟲的幼蟲寄生于骨組織，即可發(fā)生骨棘球蚴病。針對骨包蟲病，現(xiàn)有的藥物、手術等治療手段療效差，復發(fā)率及致殘率高。近些年，三維適形調強放療(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)因其良好的腫瘤殺滅率、周圍器官保護性等臨床優(yōu)勢，已成為臨床腫瘤治療最重要的手段之一。根據(jù)IMRT對腫瘤細胞有很好的殺滅效果及對周圍器官良好的安全保護作用，部分學者認為IMRT對骨棘球蚴細胞也應該有很好的殺滅作用，而且對周圍組織很好的生物安全性[2-4]。本研究通過模擬臨床對棘球蚴病區(qū)實施IMRT，觀察IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的殺滅效果及周圍神經的損傷，以期探討IMRT對骨棘球蚴病的治療有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1實驗動物的選取及放射治療選用中國武警總醫(yī)院實驗動物實驗室提供的雙側股骨繼發(fā)性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。將骨包蟲大鼠先行X線及CT檢查，均提示股骨繼發(fā)性棘球蚴接種成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯臥位擺置于自制的放療體膜內并穩(wěn)定固定。采用飛利浦Mx8000多層螺旋CT掃描機對左側股骨棘球蚴病區(qū)進行掃描，掃描密度為1 mm/層，將收集的數(shù)據(jù)上傳到Somavison系統(tǒng)內，進行信息重建，并將周圍的血管、肌腱、神經、皮膚勾畫為需要保護的器官。勾畫完放療區(qū)域后，利用三維適形調強放療儀的計算機計算系統(tǒng)對骨包蟲區(qū)域的放射劑量及劑量分布均勻程度按照放療計劃進行分析和計算。經專業(yè)放射物理師對50只鼠股骨棘球蚴病區(qū)給予40 Gy劑量的IMRT治療。

1.2取材將經IMRT放射治療后的棘球蚴病鼠吸入麻醉處理后，空氣栓塞活殺處死，在顯微鏡下取出股骨骨髓腔內的棘球蚴的包囊，經甲醛、戊二醛浸泡保存以及液氮低溫保存。

1.3Westernblot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達使用RIPA裂解細胞抽提總蛋白, BCA法蛋白定量。將樣本轉膜到PVDF膜上，脫脂牛奶后進行封閉, 添加一抗(β-actin, 1∶2 000；Caspase-3, 1∶200) ，室溫過夜。沖洗后加入二抗，室溫保存沖洗后, ECL顯影。采用Western blot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3的表達。

1.4光鏡、電鏡檢測坐骨神經神經元細胞形態(tài)將經甲醛固定的標本，石蠟包埋后行4 μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察坐骨神經神經元的組織學改變。將經戊二醛、鋨酸處理后的坐骨神經組織再次進行浸泡，用緩沖液進行反復沖洗，然后采用階梯濃度的醫(yī)學酒精進行反復脫水處理，再次用緩沖液進行反復沖洗后將其浸泡于丙酮中低溫保存。采用環(huán)氧樹脂、固化劑等進行浸泡后包埋并烘干，將組織塊進行休整并切片后鋪于金屬銅網(wǎng)表面。依次進行枸櫞酸鉛、醋酸鈾染色。在光鏡、電鏡下觀察接受放療后坐骨神經神經元細胞的形態(tài)學。

2 結果

2.1Westernblot法定量檢測骨棘球蚴包囊中凋亡相關蛋白Caspase-3表達的結果Western blot法檢測到大鼠股骨棘球蚴包囊的細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3大量表達，見圖 1。

圖1 Western blott檢測Caspase-3蛋白表達圖

2.2光鏡、電鏡檢測坐骨神經神經元細胞形態(tài)結果HE染色顯示接受IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經神經元細胞形態(tài)基本正常，少量神經元細胞為可逆性變化，神經元細胞形態(tài)為三角形或多邊形，樹突軸突清晰可見，細胞核形態(tài)飽滿，結構均正常，尼氏小體數(shù)量豐富，于胞漿內分布均勻(圖2)。透射電鏡檢測結果顯示，接受IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經神經元細胞正常形態(tài)，細胞膜未出現(xiàn)破裂，胞質內細胞器形態(tài)完整，細胞核居中，無固縮(圖3)。

圖2 IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經神經元(HE×400)

3 討論

放射治療是治療惡性腫瘤最重要的手段之一，21世紀以來，隨著影像學技術、計算機技術的快速進展，放射治療已進入了精確放療的時代，其中三維適形調強放療(Intensity modulated radiation therapy,IMRT)已成為最具代表性的放療技術。IMRT是通過計算機控制射線的方向，將精確的、劑量高的射線集中在醫(yī)者所關心的病變組織區(qū)域，而周圍組織很少受到射線的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學者的推崇[2-4]。

圖3 IMRT放療后骨棘球蚴鼠的坐骨神經神經元(電鏡 8 000倍)

本研究結果提示IMRT作用1 w后，Western blot法檢測到鼠股骨棘球蚴包囊的細胞中凋亡相關基因Caspase-3大量表達，說明在IMRT的作用下鼠股骨棘球蚴包囊的細胞產生了不可逆性的凋亡，說明IMRT對大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的殺滅作用及其有效性。坐骨神經是下肢放療最重要的、需要保護的器官，而光鏡、電鏡檢測結果提示鼠股骨棘球蚴包囊周圍的坐骨神經神經元細胞形態(tài)結構正常，未受到放射線損傷，提示IMRT在治療骨棘球蚴病方面具有很高的周圍組織安全性。

本研究結果提示IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的治療效果，而且有很高的安全性?？紤]其原因：IMRT通過對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病靶區(qū)的精確定位、精確計劃、精確照射可以使靶區(qū)接受最大的治療放射線，而周圍組織承受的劑量大大降低，從而減少了周圍重要器官發(fā)生放射損傷的幾率。所以本實驗中并未發(fā)生普通放療治療骨棘球蚴病而出現(xiàn)的病鼠照射部位出現(xiàn)脫毛及皮膚潰瘍[5]。本研究認為臨床上將IMRT用于骨包蟲的治療，具有以下優(yōu)點: (1)體外照射，不手術，無侵入性，創(chuàng)傷小；(2)不會造成囊液和囊內容物的泄漏，減少異位種植，減少因骨包蟲囊壁破裂、溢漏引起的過敏性休克甚至死亡；(3)放射線可徹底清除深藏于松質骨、骨小梁中間的骨包蟲頭節(jié)，降低骨包蟲殘留率、復發(fā)率；(4)IMRT射線集中，局部高能殺滅骨包蟲，周圍組織損傷低，且減少長期服藥對肝、腎的損傷；(5)住院期間即可完成治療，避免患者出院后長期服藥，增加患者依從性。

本實驗初步證實IMRT對鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病有很好的治療效果，而且有很高的安全性，但本研究只是初步的動物實驗研究，要將此結果推廣、應用于臨床，還需要通過大宗的臨床研究進行驗證。

參考文獻:

[1] Wang K, Zhang X, Jin Z, et al. Modeling and analysis of the transmission of Echinococcosis with application to Xinjiang Uygur Autonomous Region of China[J]. J Theor Biol, 2013, 333(10): 78-90.

[2] 徐萬龍，瓦熱斯江·尼牙孜，塔依爾江·舉來提，等. 三維適形調強放療聯(lián)合口服阿苯噠唑對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病的治療作用[J]. 醫(yī)學動物防制, 2012, 28(11): 1181-1183.

[3] 徐萬龍，繆曉剛，塔依爾江·舉來提，等. 三維適形調強放療對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病的影響[J]. 中國實用醫(yī)刊, 2012, 39(18): 41-43.

[4] Xu WL, Xilinbaoleri, Liu H, et al. Spinal cord biological safety of image-guided radiation therapy versus conventional radiation therapy[J]. Neural Regenerat Res, 2012, 7(35): 2755-2760.

[5] 謝增如，李振環(huán). 骨細粒棘球蚴病動物模型的放療效果[J]. 中國實驗外科雜志, 2009, 26(12): 1768.