IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴殺滅效果的實驗研究

樊勤學， 徐江波， 袁 宏， 周文正， 孫俊剛， 趙喜濱， 王 浩， 徐萬龍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科， 烏魯木齊 830001)

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病(Hydatid Disease)，是指由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲(E.oligarthrus)、寡節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthrus Diesing)和福氏棘球絳蟲(E.vogeli Rausch &Bernstein)的幼蟲在人畜之間相互傳染的寄生蟲病，嚴重危害全球人類的健康。我國包蟲病的發(fā)病率很高[1]，尤其是地處邊疆的新疆[2-3]。骨包蟲在人體各臟器包蟲病的發(fā)病率位居第3位，肝臟和肺臟的包蟲病發(fā)病率則位居第1、2位。臨床上針對骨包蟲的治療仍然以手術為主，但由于骨松質的存在，骨包蟲的復發(fā)率很高。而由于藥物在骨包蟲囊內的濃度極低，所以藥物治療效果差。采用三維適形調強放療(IMRT)對骨包蟲實施根治性、無侵入性放療，是一種較為理想的治療方法，但迄今IMRT對骨包蟲的殺滅效果、可能的機制人們仍知之甚少，目前尚無成熟的報道。為觀察IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的殺滅效果，本研究通過對骨包蟲病大鼠骨棘球蚴病灶區(qū)實施IMRT，檢測骨棘球蚴包囊中細胞凋亡情況及凋亡相關基因Caspase-3的表達情況，以期為臨床上將IMRT用于骨包蟲的治療提供實驗室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物選用中國武警總醫(yī)院實驗動物實驗室提供的雙側股骨繼發(fā)性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。將骨包蟲大鼠先行X線及CT檢查，均提示股骨繼發(fā)性棘球蚴接種成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯臥位擺置于自制的放療體膜內，并穩(wěn)定固定。采用飛利浦Mx8000多層螺旋CT掃描機對左側股骨棘球蚴病區(qū)進行掃描，掃描密度為1 mm/層。將收集的數(shù)據(jù)上傳到Somavison系統(tǒng)內，進行信息重建，并將周圍的血管、肌腱、神經(jīng)、皮膚勾畫為需要保護的器官。勾畫完放療區(qū)域后，利用三維適形調強放療儀的計算機計算系統(tǒng)對骨包蟲區(qū)域的放射劑量及劑量分布均勻程度按照放療計劃進行分析和計算。經(jīng)專業(yè)放射物理師在14 d內，對50只大鼠左側股骨骨棘球蚴病區(qū)分別給予40 Gy劑量的IMRT治療，右側股骨只給予假照射作為陰性對照。

1.2取材將經(jīng)IMRT放射治療后的棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，空氣栓塞活殺處死，在顯微鏡下取出雙側股骨骨髓腔內的骨包蟲的包囊，經(jīng)甲醛、戊二醛浸泡后低溫保存。

1.3電鏡檢測將標本經(jīng)戊二醛、鋨酸處理后的包蟲組織進行浸泡后用緩沖液進行反復沖洗，采用階梯濃度的醫(yī)學酒精進行反復脫水處理，再次用緩沖液進行反復沖洗，浸泡于丙酮中進行低溫保存。標本采用環(huán)氧樹脂、固化劑等進行浸泡后包埋并烘干，對組織塊進行休整并切片后鋪于金屬銅網(wǎng)表面，依次進行枸櫞酸鉛、醋酸鈾的染色。通過電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細胞的形態(tài)學進行觀察。

1.4RT-PCR檢測Caspase-3基因上下游引物序列為F： 5′AGATCACAGCAAAAGGAGCAGT3′；R：5′TCAAGCTTGTCGGCATACTGT3′。將骨棘球蚴病的組織采用液氮進行研磨，裝入含有Trizol的離心管中，將其充分混勻、裂解、沉淀并澄明，加入氯仿后混勻，加入異丙醇并混勻，離心后棄上清，加入乙醇后沉淀，棄上清后將沉淀進行保留、干燥。加入DEPC后溶解，進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析測定。將骨棘球蚴的Caspase-3的RNA從-80℃冰箱取出，解凍后組配逆轉錄反應的體系。在PCR儀上加少量冰進行冷卻，加入Frist-Strand Buffer、RNasin、TIANScript M-MLV、Total Volume，將以上體系進行配比后離心，在PCR儀上加溫并終止反應，冷卻后進行稀釋。配制PCR反應體系，調節(jié)ABI7500熒光定量PCR循環(huán)條件。對結果進行分析：擴增完畢后，進入結果分析界面，以 GAPDH 為內參照基因，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1透射電鏡觀察IMRT對骨包蟲的殺滅效果透射電鏡結果提示，未接受放療鼠骨棘球蚴包囊細胞正常形態(tài)存在，細胞膜未出現(xiàn)破裂，胞質內細胞器形態(tài)完整，細胞核居中，無固縮(圖1)。經(jīng)放射治療后的骨包蟲的囊壁可見大量的變性壞死，生發(fā)細胞大量減少，細胞板層結構受損、出現(xiàn)層列，間隙間可見空泡樣改變，甚至一些細胞直接出現(xiàn)崩裂樣狀態(tài)，無法分辨正常的細胞形態(tài)。所有正常細胞形態(tài)消失，細胞胞質排列疏散，線粒體變粗腫脹，線粒體內嵴擁擠、斷開，內質網(wǎng)脫顆粒樣改變、疏松，細胞核崩裂、固縮，可見凋亡小體(圖2)。

圖1 未接受放療骨棘球蚴包囊細胞(電鏡8 000倍)

圖2IMRT放療后骨棘球蚴包囊細胞(電鏡8000倍)

2.2RT-PCR檢測凋亡相關基因Caspase-3的表達情況RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IMRT作用后的左側股骨棘球蚴包囊細胞凋亡相關基因Caspase-3大量表達，Caspase-3 mRNA 的RQ值為(67.39±17.35)。但未接受IMRT治療的右側股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細胞凋亡相關基因Caspase-3的表達極少量，Caspase-3 mRNA 的RQ值為(1.43±0.53)，左側與右側股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細胞凋亡相關基因Caspase-3的表達差異具有統(tǒng)計學意義(t=7.984，P<0.05)。

3 討論

自1996年美國紐約的Memorial Sloan-Kettering Cancer Center首先發(fā)表文章闡述適形調強放射治療技術至今，IMRT已有15 a的發(fā)展歷史。IMRT是通過計算機來控制射線的方向，可將精確的、劑量高的射線集中在醫(yī)者所關心的病變組織區(qū)域，而周圍組織很少受到射線的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學者的推崇。根據(jù)IMRT對腫瘤細胞有很高的殺滅作用，筆者認為IMRT對骨包蟲的細胞也應該有很好的殺滅作用。故本研究通過對骨包蟲病實施IMRT，通過電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細胞形態(tài)學進行觀察，結果表明經(jīng)放射后的骨包蟲的囊壁可見大量的變性壞死，所有正常細胞形態(tài)消失，細胞胞質排列疏散，線粒體變粗腫脹，線粒體內嵴擁擠、斷開，內質網(wǎng)脫顆粒樣改變、疏松，細胞核崩裂、固縮，可見凋亡小體，以上顯微鏡下所觀察到的現(xiàn)象均為放射性骨壞死典型的病理改變，所以本研究認為IMRT可以集中射線，局部高能殺滅骨包蟲，而且放射線可徹底清除深藏于松質骨、骨小梁中間的骨包蟲頭節(jié)，降低骨包蟲殘留率、復發(fā)率。本研究表明，骨棘球蚴包囊細胞對IMRT的射線敏感，IMRT對骨棘球蚴包囊細胞有較明顯的殺傷作用，以上結果與IMRT臨床上直接應用于多數(shù)腫瘤細胞的實驗結果相同[4-6]。

本實驗證明了IMRT對殺滅骨棘球蚴病有很好的效果，IMRT可促進新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴包囊細胞的凋亡。IMRT對殺滅骨棘球蚴有2條途徑[4-6]：(1)直接損傷效應：指組織細胞的關鍵生物大分子直接吸收射線的能量所造成的損傷；(2)間接損傷效應：指生物大分子及其周圍的其他分子(主要為水分子)在吸收射線的能量后產(chǎn)生大量的氧自由基，繼而發(fā)揮對關鍵生物大分子的損傷效應。其中DNA是電離輻射作用的主要靶分子之一，電離輻射可導致多種形式的DNA損傷，如堿基變化、脫氧核糖變化、DNA鏈斷裂和交聯(lián)(DNA鏈交聯(lián)和DNA-蛋白交聯(lián))。而DNA鏈斷裂是輻射損傷的主要形式，其中DNA單鏈斷裂與輻射劑量呈線性關系，但DNA雙鏈斷裂可高于射線的直接電離作用；而且射線還可干預堿基損傷以及單鏈DNA斷裂之后的損傷修復過程，如果是雙鏈DNA斷裂，則可導致細胞致死性的損傷。

本研究結果顯示，經(jīng)RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，IMRT作用后的左側股骨棘球蚴包囊細胞凋亡相關基因Caspase-3大量表達，但未接受IMRT治療的右側股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細胞凋亡相關基因Caspase-3的表達極少量。凋亡蛋白酶的激活是凋亡發(fā)生機制中最關鍵的環(huán)節(jié)之一，Caspase家族活化對放射后骨棘球蚴細胞的凋亡起著至關重要的作用。Caspase家族本質上是天冬氨酸蛋白酶，因此在正常的細胞體內都以無活性的酶原狀態(tài)存在。但是當細胞受損傷而產(chǎn)生凋亡時，首先表現(xiàn)為Caspase 活化，其余的 Caspase依次關聯(lián)為級聯(lián)反應，從而產(chǎn)生、促進細胞凋亡。Caspase的成員有很多，其中與凋亡的關系最為密切的因子是Caspase-3，其作用于凋亡的中期，而且其在細胞凋亡效應階段起核心作用。

本研究針對大鼠股骨骨棘球蚴區(qū)域給予40 Gy劑量的IMRT治療，從照射后棘球蚴包囊細胞的形態(tài)結構改變、凋亡因子的表達均提示：IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴有很好的殺滅作用。提示通過IMRT合理的放療方案的實施，臨床可達到對骨棘球蚴的創(chuàng)傷小、療程短、根治性的治療。本研究初步證實IMRT可以直接導致新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴包囊細胞的凋亡，可以通過激活Caspase-3誘導生發(fā)細胞凋亡，但是IMRT如何讓激活 Caspase-3誘導細胞凋亡的上游事件還不清楚，有待進一步探索。

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