基于核磁共振的甲狀腺乳頭狀癌患者血漿的代謝組學(xué)研究

阿布都沙拉木·阿布力， 艾力·賽丁， 哈力木拉提·木爾扎提， 熱娜·米吉提，阿布來提·麥麥提艾力， 夏米西努爾·伊力克

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011; 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科， 烏魯木齊 830001;新疆醫(yī)科大學(xué)3第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科， 烏魯木齊 830054; 4第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 烏魯木齊 830028)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC) 是指甲狀腺組織的癌變，約占全身腫瘤的2%[1]。近年甲狀腺癌在全球發(fā)病率有逐年上升的趨勢，美國每年診斷的分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)為23 500 例，年發(fā)病率逐漸增加，主要是乳頭狀甲狀腺癌發(fā)病率增加[2-3]。甲狀腺癌分為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡狀癌和甲狀腺髓樣癌等，其中PTC最為常見，占65%～75%，容易導(dǎo)致聲音嘶啞、吞咽困難、咳嗽、咯血等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生命健康，因而需要加強對甲狀腺癌的診斷和治療[4]。臨床上術(shù)前診斷甲狀腺癌主要的方法是常規(guī)的細(xì)針穿刺(FNA) 分析，此方法被認(rèn)為是最準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)有效的診斷方法，但還有30%的病例不能明確診斷[5]，使得很多患者遭受不必要的手術(shù)，從而無法真正實現(xiàn)癌癥早期準(zhǔn)確診斷。臨床上需要找到更為敏感、可靠的診斷方法和腫瘤標(biāo)記物,以便于做出早期診斷。代謝組學(xué)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的新興組學(xué)。其著重研究腫瘤診斷、腫瘤分級、腫瘤復(fù)發(fā)診斷等方面[6-9]。代謝組學(xué)有獨特的優(yōu)勢，其從代謝物層面來探究生命活動，反映已經(jīng)發(fā)生的生物學(xué)事件，其可通過研究生物樣品內(nèi)代謝物的水平及變化，了解不同生物系統(tǒng)的復(fù)雜生理及病理狀況[10-13]。

核磁共振技術(shù)在代謝組學(xué)研究方法中具有使用廣泛、檢測譜廣、方法簡便及對樣品進(jìn)行快速、無創(chuàng)、無偏向性分析等優(yōu)點[14]。本研究采用核磁共振氫譜(1H-NMR)法檢測甲狀腺乳頭狀癌患者和健康人血漿中的代謝物，比較分析兩組血漿差異性代謝物。同時利用最小二乘判別分析(OPLS-DA)對NMR譜數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別分析，鑒別兩組受試者，并分析對鑒別兩組受試者有幫助的代謝標(biāo)志物，以期作為早期診斷甲狀腺乳頭狀癌的一種方式。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Inova600型核磁共振波譜儀(美國Varian公司)，電子天平(北京賽多克斯天平有限公司)，低溫超速離心機(美國Beckman公司)，低溫冰箱(中國海爾公司)，核磁管(美國 Wilmad Lab Glass公司)，重水(美國Sigma公司)，NaCl，K2HPO4，NaH2PO4，蒸餾水。

1.2樣品收集收集2012年11月-2013年8月新疆醫(yī)科大學(xué)第一、第二附屬醫(yī)院和新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院31例甲狀腺乳頭狀癌患者(甲狀腺乳頭狀癌組)和29例健康人(健康對照組)血液樣品。2 h內(nèi)4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液(血漿)，置-80℃冰箱保存待用。

1.3樣品預(yù)處理將-80℃冰箱里的血漿放置室溫自行融化，隨后取200 μL放入1.5 mL的 EP管，再加400 μL重水配置的緩沖液(0.045 M NaH2PO4+0.045 M K2HPO4+NaCl溶于20%重水+80%蒸餾水)后混合，以10 000 r/min離心10 min后取上清550 μL灌入5 mL的核磁管,放入4℃冰箱待用。

1.4核磁共振實驗在核磁共振波譜儀上調(diào)整脈沖序列對樣品進(jìn)行測定。采用預(yù)飽和方式抑制水峰信號,飽和時間為2 s, 譜寬10 000 Hz, 采樣點數(shù)32 768 k, 掃描次數(shù)為128次, 每次掃描時間為1.638 s, 實驗溫度25.0℃。選取一維氫譜質(zhì)量較高的樣品進(jìn)行二維譜測試,

1.5譜圖預(yù)處理采用TOPSPIN2.0 軟件對譜圖進(jìn)行手動基線調(diào)整，所有樣品譜圖的α-葡萄糖左峰作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定標(biāo)，譜圖中的位置設(shè)為5.233。對所有譜圖進(jìn)行自動積分，積分區(qū)間設(shè)為0.003 ppm。將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Exel文件中，取出4.680～5.202 ppm的抑制水峰引起譜圖差異的數(shù)據(jù)。為了消除不同濃度的樣品所致的誤差，對剩下的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

1.6模式識別分析采用SIMCA-P 軟件對兩組血漿的核磁共振實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminate Analysis, OPLS-DA),得到兩組樣品相應(yīng)的散點圖和三維圖。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理為了分析甲狀腺乳頭狀癌組血漿與健康對照組血漿樣品的特異性代謝物，采用PCA方法對樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過OPLS-DA獲得的每一個積分段所代表的代謝物相關(guān)系數(shù)(r)來確定各組人血漿中有差異性的代謝成分，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。本研究中，根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測，確定|r|值>0.349(樣品數(shù)n=30)所代表的代謝物是有差異性(P<0.05)的代謝物，臨界值|r|值越大表示差異性越大，反之越小。與健康對照組相比，差異性代謝物中相關(guān)系數(shù)為正值的代謝物是在甲狀腺乳頭狀癌組血漿中含量增高的代謝物，相關(guān)系數(shù)為負(fù)值的代謝物是在甲狀腺乳頭狀癌組血漿中含量降低的代謝物。

2 結(jié)果

2.1兩組血漿樣品的1H-NMR分析結(jié)果甲狀腺乳頭狀癌組血漿與健康對照組血漿樣品1H-NMR譜圖所示的1～26為有差異的26種代謝物(圖1)。

b: 甲狀腺乳頭狀癌組

2.2OPLS-DA分析結(jié)果PCA積分值散點圖(圖2a)和其三維圖(圖2b)顯示兩組間的分離分布趨勢很清晰。OPLS-DA分析結(jié)果顯示甲狀腺乳頭狀癌組與健康對照組血漿代謝物有明顯差異。對應(yīng)的載荷圖顯示，有一部分成分離原點分布比較遠(yuǎn)，表示這些成分有明顯差異，如β-Glu(3.49 ppm)、鯊肌醇(3.35 ppm)、α-Glu(3.72 ppm)、膽堿(3.21 ppm)、甘氨酸(3.55 ppm)、肌醇(3.65 ppm)、甲基組氨酸(7.05 ppm)、苯丙氨酸(7.32 ppm)、丙酮酸(2.36 ppm)、不飽和脂類(5.28 ppm)、酪氨酸(7.18 ppm)、低密度脂蛋白(LDL，1.25 ppm，4.25 ppm)、乳酸(1.33 ppm)、極低密度脂蛋白(VLDL,0.86 ppm)(圖2c)。

a: OPLS-DA分析散點圖;

2b: 三維圖;

2c: 載荷圖

2.3差異性代謝物的相關(guān)系數(shù)分析根據(jù)以上信息及用H1-H1同核相關(guān)譜(COSY譜)、質(zhì)子全相關(guān)譜(TOCSY譜)、J-分解譜等二維譜技術(shù)確定了兩組血漿代謝物有差異性，與健康對照組相比,甲狀腺乳頭狀癌組血漿中極低密度脂蛋白、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、低密度脂蛋白、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酰胺、肉堿、α-酮戊二酸、肌酸、甘氨酸、不飽和脂類、酪氨酸、甲基組氨酸、苯丙氨酸的含量降低，同時丙酮酸、檸檬酸、肌酸酐、膽堿、鯊肌醇、β-葡萄糖、肌醇、α-葡萄糖和甲酸的含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

3 討論

本研究運用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)分析了健康對照組和甲狀腺乳頭狀癌組血漿中有差異的代謝物，從PCA結(jié)果分析，健康對照組和甲狀腺乳頭狀癌組在積分散點圖上很明顯地分開。用代謝組學(xué)的方法對體液進(jìn)行分析可獲得與內(nèi)環(huán)境變化有關(guān)的生物標(biāo)志物及這種變化的機制信息 。用二維譜技術(shù)確定了差異性代謝物，如患者血中α-葡萄糖、β-葡萄糖的含量均有所增加，可能是患者體內(nèi)糖異生作用增強的結(jié)果，糖代謝的場所是肝臟，肝糖原加速分解和其他非糖物質(zhì)的糖異生作用產(chǎn)生的葡萄糖使血糖含量增高。

表1 健康對照組與甲狀腺乳頭狀癌組血漿主要差異性代謝物及相關(guān)系數(shù)

肉堿與免疫系統(tǒng)的功能有關(guān)，并可能參與支鏈氨基酸的新陳代謝。本研究顯示甲狀腺乳頭狀癌組血漿中肉堿含量減少，可能導(dǎo)致患者免疫力下降。甲狀腺乳頭狀癌組血漿中肌醇和鯊肌醇的含量升高，其有代謝脂肪和膽固醇的作用，可降低膽固醇。本研究結(jié)果同樣顯示甲狀腺乳頭狀癌組血漿中低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白等脂質(zhì)的含量降低?？赡芘c甲狀腺乳頭狀癌會引起脂類代謝的紊亂及血脂清除率增加有關(guān)[15-20]。

α-酮戊二酸有生成氨基酸的功能(α-酮戊二酸能夠通過轉(zhuǎn)氨基作用生成谷氨酸)，還有各類氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、甲基組氨酸、苯丙氨酸在甲狀腺乳頭狀癌組血漿中的含量降低，表明甲狀腺乳頭狀癌患者體內(nèi)氨基酸代謝分解加強，原因可能是甲狀腺乳頭狀癌使患者體內(nèi)某些氨基酸的酶活性增加，導(dǎo)致氨基酸含量降低。

甲狀腺乳頭狀癌組血漿中的檸檬酸含量增高，三羧酸循環(huán)中檸檬酸的發(fā)酵機理逐漸被人們所認(rèn)識。已經(jīng)證明，糖質(zhì)生成檸檬酸的生化過程中，由糖變成檸檬酸并進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑，甲狀腺乳頭狀癌可能加速了糖質(zhì)的利用。

此外，膽堿的代謝包含膽堿和磷脂酰膽堿，是細(xì)胞膜和磷脂脂蛋白的組成成分，對細(xì)胞膜的完整性和脂類的代謝發(fā)揮著重要的作用。與危陽洋等[20]對甲亢血清的研究相比,甲狀腺乳頭狀癌組血漿中膽堿的含量增加，同樣可能破壞細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致對細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了損傷。

本研究從代謝產(chǎn)物水平對甲狀腺乳頭狀癌組以及健康對照組血漿代謝物特征進(jìn)行了研究，并得到一組差異性的血漿代謝物，而非單個代謝物，結(jié)合OPLS-DA模式識別技術(shù)能夠?qū)山M人群分離開來，這種組學(xué)技術(shù)可能為臨床甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷和早期治療提供一種思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Greenlee RT, Hill-Harmon MB, Murray T, et al. Cancer statistics, 2001[J]. CA Cancer Clin, 2001, 51(1):15-36.

[2] 張躍武, 高維生, 詹偉松.應(yīng)更好地規(guī)范甲狀腺癌的初次手術(shù)[J]. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2006,13(3):254-255.

[3] Hegedus L.Clinical practice:the thyroid nodule[J]. N Engl Med, 2004, 35(1):1764-1771.

[4] 王征新, 楊波. 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫合并甲狀腺癌20例臨床探析[J].臨床與實踐, 2013,17(17):2224-2225.

[5] Moses W, Weng J, Sansano I, et al. Molecular testing for somatic mutations improves the accuracy of thyroid fine-needle aspiration biopsy[J].World J Surg， 2010, 34(11):2589-2594.

[6] Kunle O，Robert M，Christine B，et al.Detection of epithelial ovarian cancer using H-NMR based metabonomics[J]. Int J Cancer, 2005, 113(5):782-788.

[7] Thysell E，Pohjianen E，Lindberg J，et al.Reliable profile detection in comparative metabolomics[J].OMICS, 2007, 11(2):209-224.

[8] Duarte IF, Goodfellow BJ, Barros A, et al. Metabolic characterization of plasma injuveniles with glycogen storage disease type la (GSDla)by high-resolution 1H-NMR spectroscopy[J]. NMR Biomed, 2007, 20(1):401-412.

[9] Hu C, van der Heijden R, Wang M, et al. Analytical strategies in lipidomics and applications in disease biomarker discovery[J] . Chromatography B, 2009, 877(26):2836-2846.

[10] Yuan KL, Kong HW, Guan YF, et al. GC-MS Based Plasma Metabolic Profiling of Type 2 Diabetes Mellitus[J]. Chromatography B, 2007, 850(10):236-240.

[11] Xu J，Zhang J，Dong JY，et al. Metabonomics studies of intact hepatic and renal cortical tissues from diabetic db/db mice using high-resolution magic-angle spinning 1H-NMR spectroscopy[J]. Anal Bioanal Chem , 2009, 393(10):1657-1668.

[12] Akira K, Imachi M, Hashimoto T. Investigations into biochemical changes of genetic hypertensive rats using 1H nuclear magnetic resonance-based metabonomics[J]. Hypertension Res, 2005, 28(5):425-430.

[13] Dumas ME, Barton RH, Toye A, et al. Metabolic profiling reveals a contribution of gut microbiota to fatty liver phenotype in insulin-resistant mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(33):12511-12516.

[14] Gowda GAN, Zhang S, Gu H, et a1. Metabolomics-based methods for early disease diagnostics:a review[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2008, 8(5):617-633.

[15] Guerrero A, Pamplona R, Portero-Otin M, et al. Effect of thyroid status on lipid composition and peroxidation in the mouse liver[J].Free Radic Biol Med，1999，26(1):73-80.

[16] Costantini F, Pierdomenico SD, De Cesare D, et al. Effect of thyroid function on LDL oxidation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998，18(5):732-737.

[17] Magsino CH, Hamouda W, Ghanim H, et al. Effect of triiodothyronine on reactive oxygen species generation by leukocytes, indices of oxidative damage, and antioxidant reserve[J]. Metab Clin Exp, 2000, 49(6):799-803.

[18] Gredilla R, Barja G, Lopez-Torres M . Effect of short-term caloric restriction on H2O2 production and oxidative DNA damage in rat liver mitochondria and location of the free radical source[J]. Bioenerg Biomembr, 2001, 33(4):279-287.

[19] Nedvidkova J, Haluzik M, Baak V, et al. Proceedings of the 8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress[J]. New York Acad Sci, 2003,37(2):81-136.

[20] 危陽洋, 王彩虹, 李偉, 董繼揚, 陳忠, 甲亢患者血清和尿液的核磁共振[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報, 2010, 2(2):279-284.