兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的克隆及其序列分析

韓樂樂 李作磊 茍惠天 孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

豆?fàn)钅椅豺适菐Э疲═aeniidae）帶屬（Taenia）的豆?fàn)顜Ы{蟲（Taenia pisiformis）的中絳期蚴蟲，常寄生于家兔等嚙齒動物的肝臟、大網(wǎng)膜、腸系膜和腹腔內(nèi)引起其豆?fàn)钅椅豺什。?]。當(dāng)終末宿主（如犬、狼、狐等）吞食了感染豆?fàn)钅椅豺实闹虚g宿主組織后，豆?fàn)钅椅豺试谄湫∧c中發(fā)育為豆?fàn)顜Ы{蟲［2]。該病呈世界性分布［3-5]，我國各地均有發(fā)生［6]。該病的流行，不僅對公共衛(wèi)生及兔肉食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重影響。

目前，帶科絳蟲免疫診斷抗原的研究主要集中在一些低分子量抗原方面［7-10]。研究證明，在帶科絳蟲囊尾蚴病診斷中具有較好應(yīng)用價(jià)值，如10、14和18 kD等抗原都屬于8 kD基因家族成員，只是糖基化修飾程度的差異而形成大小不同的蛋白分子。Ferrer等［7，11]對 8 kD抗原家族基因進(jìn)行研究發(fā) 現(xiàn)，Ts8ku糖蛋白顯示出良好的免疫反應(yīng)性，在豬囊尾蚴病診斷方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。Sako等［12]使用多房棘球蚴Em18重組抗原建立的免疫層析檢測方法敏感性和特異性均達(dá)到94%以上。Yong等［13]對豬帶絳蟲RS1基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其能夠與宿主的脂肪酸結(jié)合從而獲得能源，有助于絳蟲在宿主體內(nèi)寄生，然而這種結(jié)合作用同時(shí)會受到RS1抗原的特異性抗體的抑制作用。Lee等［14]通過研究豬帶絳蟲的150 kD疏水性結(jié)合蛋白（HLBP）調(diào)節(jié)脂肪酸吸收的機(jī)制，結(jié)果表明HLBP調(diào)節(jié)宿主脂肪酸的吸收可能是寄生蟲生存的關(guān)鍵因素。迄今為止，國內(nèi)外對有關(guān)豆?fàn)钅椅豺剩–ysticercus pisiformis）免疫學(xué)診斷方面的研究工作尚少，僅有1992年倪澤成等對其粗提抗原進(jìn)行研究的初步報(bào)道，但粗提抗原在純化方法上的缺陷限制了其推廣應(yīng)用［7]。

本研究初次以低分子量抗原RS1為靶基因，通過對GenBank中登錄的豬帶科絳蟲RS1基因序列進(jìn)行比對，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR，克隆到具有完整開放閱讀框（ORF）的cDNA分子RS1，旨在通過對目的基因及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，為該基因的克隆表達(dá)及免疫學(xué)特性的初步研究提供理論依據(jù)，從而為其生物學(xué)功能研究及在免疫診斷與疫苗方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株與菌株 豆?fàn)钅椅豺什勺匀斯じ腥就玫拇缶W(wǎng)膜等處；無菌生理鹽水沖洗3-4次，-70℃保存?zhèn)溆?。E. coliJM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；RNA simple Total RNA Kit、TIANgel Midi Purification Kit和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的克隆 根據(jù)GenBank中登錄的豬帶絳蟲TSOL RS1基因序列（登錄號DQ8650721），用Oligo軟件設(shè)計(jì)一對引物，上游引物：5'-ATGCGTGCCTACATTGTGCTT-3'；下游引物：5'-GCATGAAAGTTGACAAGTTAAGCAG-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照Trizol試劑說明抽提兔豆?fàn)钅椅豺士俁NA。將提取的總RNA按照RNA simple Total RNA Kit說明合成cDNA，用上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴(kuò)增片段的長度。電泳檢測后目的基因按TIANgel Midi Purification Kit試劑盒操作說明回收純化。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體于4℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于Amp+LB固體平板，37℃培養(yǎng)14-16 h，鑒定為陽性克隆送測序公司測序。

1.2.2 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的ORF序列分析 在 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/g orf/gorf.html上利用ORF finder軟件確定兔豆?fàn)钅椅豺驶騎pRS1完整的ORF序列，并推導(dǎo)編碼蛋白的氨基酸序列。

1.2.3 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的生物信息學(xué)分析

1.2.3.1 基本理化性質(zhì)分析 利用Protparam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成等。利用ProtScale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質(zhì)親、疏水性。

1.2.3.2 信號肽和跨膜區(qū)分析 利用SignalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽位點(diǎn)。應(yīng)用TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析程序預(yù)測跨膜區(qū)域。

1.2.3.3 二級結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測 應(yīng)用Predictprotein（http：//www.predictprotein.org）對蛋白二級結(jié)構(gòu)及抗原表位作進(jìn)一步分析。應(yīng)用MotifScan（http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN）預(yù)測蛋白糖基化位點(diǎn)。

1.2.3.4 同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析 用BlastP軟件對兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1氨基酸序列與GenBank中其他帶科絳蟲的同源性進(jìn)行比對。運(yùn)用MEGA5中的Maximum parsimony（MP）法軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的克隆

以提取的兔豆?fàn)钅椅豺士俁NA為模板進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，在約250 bp出現(xiàn)特異性條帶（圖1），與理論預(yù)測值大小相符。

圖1 PCR產(chǎn)物鑒定

2.2 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因的ORF序列分析

使用NCBI的ORF Finder程序?qū)寺〉耐肨pRS1基因序列進(jìn)行開放性閱讀框分析并推測其氨基酸序列，結(jié)果（圖2）顯示，TpRS1含有長度為258 bp的開放閱讀框，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，編碼85個(gè)氨基酸。

2.3 兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) TpRS1所編碼的85個(gè)氨基酸殘基組成的多肽的理論分子質(zhì)量為9.6 kD，理論等電點(diǎn)為9.07，原子組成是C431H710N110O122S6。該蛋白質(zhì)由19種氨基酸組成，其中Lys含量最豐富，不含Gln，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）12個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）15個(gè)。脂肪系數(shù)為95.29，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）為37.58，低于閾值40，表明該蛋白狀態(tài)穩(wěn)定。

2.3.2 TpRS1基因編碼蛋白的疏水性/親水性預(yù)測和分析 運(yùn)用ProtScale工具對兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因編碼蛋白進(jìn)行親水性和疏水性分析。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知：兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因編碼蛋白多肽鏈第22位Pro具有最低的分值-1.600和最強(qiáng)的親水性；第87位Cys具有最高的分值3.133和最強(qiáng)的疏水性。平均親水性為-0.021，表明該蛋白可能是一個(gè)疏水性蛋白（圖3）。該結(jié)果與DNASTAR軟件分析結(jié)果基本一致。

圖3 TpRS1基因編碼蛋白疏水性分析

2.3.3 信號肽和跨膜區(qū)分析 用SignalP 3.0對TpRS1基因編碼蛋白進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明該蛋白不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。用TMHMM2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)此編碼蛋白所有氨基酸部分位于膜表面，部分位于膜內(nèi)（圖4），證實(shí)TpRS1基因編碼蛋白是一種跨膜蛋白。

圖4 TpRS1基因編碼蛋白的信號肽分析

2.3.4 二級結(jié)構(gòu)及其蛋白功能的預(yù)測 預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占70.59%，β折疊占5.88%，其余23.53%為無規(guī)卷曲，屬于混合型二級結(jié)構(gòu)。該蛋白基序無N-糖基化位點(diǎn)?？乖稽c(diǎn)預(yù)測顯示，其氨基酸序列的2、44、45、66、72和76位為抗原表位（圖6）。

圖5 TpRS1二級結(jié)構(gòu)的模擬圖

2.3.5 TpRS1蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析 在GenBank進(jìn)行Blast查詢發(fā)現(xiàn)，TpRS1為尚未報(bào)道的新序列。通過與GenBank中登錄的其他帶科絳蟲的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析顯示，TpRS1編碼的氨基酸序列與泡狀帶絳蟲（ACI42356）的氨基酸序列相似性最高達(dá)到77%；與豬帶絳蟲（AEP03198）、多 頭帶絳蟲（ACI42323）及細(xì)粒棘球蚴（AC132106）的序列相似性都為72%（圖7）。

圖6 TpRS1抗原位點(diǎn)的預(yù)測

圖7 TpRS1推測的氨基酸序列與其他帶科絳蟲的同源性分析

根據(jù)BLAST比對結(jié)果，以細(xì)粒棘球蚴作為外群，選取部分絳蟲的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，TpRS1與泡狀帶絳蟲氨基酸序列同源性最高（圖8）。

3 討論

豆?fàn)钅椅豺什∽鳛榧彝玫囊环N重要的寄生蟲病，國內(nèi)廣泛流行，但相關(guān)研究尚少。目前，主要根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查等方面對豆?fàn)钅椅豺什∵M(jìn)行綜合診斷［15]。免疫學(xué)診斷方面的研究并不多。免疫診斷依賴于高特異性的抗原。本試驗(yàn)選取低分子量抗原基因RS1進(jìn)行克隆，首次克隆兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因，并最終成功構(gòu)建了該基因的重組質(zhì)粒，為獲得兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1抗原蛋白奠定了基礎(chǔ)。在GenBank進(jìn)行Blast查詢，發(fā)現(xiàn)該基因核苷酸序列的ORF與豬帶絳蟲RS1的相同，均為258 bp，含有起始密碼子和終止密碼子均為ATG和TAA，提示RS1基因可能由同一個(gè)祖先基因進(jìn)化而來。

圖8 MP法構(gòu)建的TpRS1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

生物信息學(xué)是目前生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最為迅速的學(xué)科，利用已建立的技術(shù)平臺和大量的數(shù)據(jù)庫體系，可以迅速準(zhǔn)確地預(yù)測目的基因或蛋白質(zhì)的特性、定位以及功能等關(guān)鍵信息。本試驗(yàn)從跨膜區(qū)分析、親水疏水性分析、信號肽分析、抗原位點(diǎn)及二級結(jié)構(gòu)分析對該蛋白的性質(zhì)功能作出系統(tǒng)預(yù)測，TpRS1編碼的氨基酸序列與泡狀帶絳蟲的氨基酸序列最相似，同源性達(dá)77%；與豬帶絳蟲、多頭帶絳蟲及細(xì)粒棘球蚴也有很高的同源性，都為72%。且與物種進(jìn)化的結(jié)果相一致，反映了RS1基因編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對生物體的功能重要性。預(yù)測發(fā)現(xiàn)其沒有信號肽序列，說明該蛋白可能為包涵體表達(dá)蛋白，從而為蛋白質(zhì)表達(dá)后蛋白的獲得部分提供了依據(jù)。該蛋白為跨膜蛋白，有一定的跨膜區(qū)，這些區(qū)段一般會形成α螺旋，穿越細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)而將該膜蛋白定位于細(xì)胞膜上，這與該蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要為α螺旋的預(yù)測結(jié)果一致。在機(jī)體內(nèi)疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白的抗原位點(diǎn)有密切的聯(lián)系，最高親水性區(qū)域常位于抗原決定簇內(nèi)部或其附近［16]。經(jīng)親水性與抗原表位的共同分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可能是一個(gè)疏水性蛋白，但有6處抗原位點(diǎn)，由此揭秘出該蛋白具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步對該基因的表達(dá)及生物學(xué)功能的研究奠定基礎(chǔ)，也為該蛋白的免疫診斷、疫苗方面的研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了兔豆?fàn)钅椅豺蔜pRS1基因，該基因序列含有一個(gè)由258個(gè)核苷酸組成的開放閱讀框，編碼85個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)軟件，成功預(yù)測并分析了TpRS1基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、抗原位點(diǎn)及與其他帶科絳蟲的同源性等。

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