嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因的克隆與序列分析

李雪 胡秀彩 蘭云 沈曉靜 呂愛軍 朱愛華

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221 116）

嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）是一種典型的魚、畜、人共患病病原菌［1，2]，主要致病因子包括外毒素、胞外蛋白酶等，并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AhyR基因有關(guān)［3]。研究表明，嗜水氣單胞菌AhyR基因調(diào)控溶血素、胞外蛋白酶等產(chǎn)生［4，5]。畢志香等［4，6]構(gòu)建嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因突變株J-1△AhyR，發(fā)現(xiàn)AhyR基因與蛋白酶、溶血素、DNA酶等主要致病因子表達有關(guān)。嗜水氣單胞菌AhyR基因突變阻止產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯，從而進一步抑制蛋白酶的產(chǎn)生［5]。Swift等［7]報道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白能夠促使胞外蛋白酶較早表達，有效防御病原菌侵入抵制感染。此外，AhyR蛋白與細菌群體感應(yīng)信號調(diào)控蛋白LuxR功能類似，參與調(diào)控生物膜形成以及胞外蛋白酶產(chǎn)生［8，9]。關(guān)于魚源嗜水氣單胞菌AhyR基因的序列分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測，目前尚未見文獻報道。本 研究從嗜水氣單胞菌Zf1菌株中克隆獲得AhyR基因，并對其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，有助于理解嗜水氣單胞菌的分子致病機理。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌Zf1菌株由本實驗室保藏。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考嗜水氣單胞菌AhyR基因序列（登錄號：YP_855090），設(shè)計特異性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR擴增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Zf1菌株AhyR基因克隆 參考李雪等［10]方法，將Zf1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液用于提取基因組DNA，具體操作參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書。將提取到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增采用10 μL體系：提取的Zf1菌株基因組DNA模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Master Mix 5.0 μL，ddH2O 3 μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸2 min，經(jīng)30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。得到目的條帶后，按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將膠回收得到的DNA片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。將AhyR基因膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆菌樣送上海生工測序。

1.2.3 基因序列及其結(jié)構(gòu)分析 用Edit seq推測氨基酸序列，利用Motif Scan、blastp程序預(yù)測結(jié)構(gòu)域，NetPhos 2.0 Server預(yù)測磷酸化位點［11]。通過鄰接法（Neighbor-Joining），應(yīng)用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。將蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，用RasMolVersion 2.7.5.2查看蛋白三級結(jié)構(gòu)，并用拉馬錢德蘭圖（Ramachandran plot）檢測蛋白模型的合理性。

2 結(jié)果

2.1 Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析

PCR擴增得到一條特異性條帶（圖1），測序獲得AhyR基因大小為1 063 bp，引物序列見圖2，推測ORF編碼260 aa；查找結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)AhyR蛋白18-168 aa區(qū)域為自體誘導(dǎo)物結(jié)合域（PF03472），176-241 aa區(qū)域為LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PS50043），183-227 aa區(qū)域為DNA結(jié)合域（PF04967）（圖3）；預(yù)測AhyR蛋白含有13個磷酸化位點，其中有8個絲氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3個蘇氨酸（30T、184T、188T、）和2個酪氨酸（161Y、231Y），進一步預(yù)測酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位點（173S、184T、210T、222T）（圖4）。

圖1 AhyR基因的PCR電泳

2.2 AhyR基因蛋白序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

對AhyR蛋白進行多重序列比對表明氣單胞屬不同菌種AhyR氨基酸序列高度保守，與殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）、維隆氣單胞菌（A. veronii）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）、中間氣單胞菌（A. media）、簡達氣單胞菌（A. jandaei）序列同源性分別為100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白與嗜水氣單胞菌（登錄號YP_855090）的AhyR蛋白親緣性最近，自然聚為一支（圖5）。

2.3 AhyR基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 Zf1菌株AhyR基因的上下游引物測序圖譜

圖3 AhyR蛋白blastp保守結(jié)構(gòu)域圖

圖4 AhyR蛋白磷酸化位點預(yù)測

進一步分析AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)，確定以群體感應(yīng)控制阻遏物的A鏈（PDB：3SZT_A）為模板，該蛋白與模板相似性達28.40%，通過SWISSMODEL在線比較建模結(jié)果，如圖6-A所示，AhyR蛋白主要由15個α螺旋、5個β折疊和19個轉(zhuǎn)角構(gòu)成，該三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)序列特征分析結(jié)果基本一致；圖6-B顯示LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域主要以α螺旋分布在三級結(jié)構(gòu)C端外側(cè)。拉馬錢德蘭圖檢測結(jié)果（圖7）表明有93.9%氨基酸序列位于最適宜區(qū)，5.9%氨基酸序列位于允許區(qū)，證實AhyR基因推導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型合理。

3 討論

圖5 鄰接法構(gòu)建AhyR蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖6 AhyR蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

嗜水氣單胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，還與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AhyR基因有關(guān)［3]。AhyR蛋白在嗜水氣單胞菌蛋白酶活性調(diào)節(jié)中起重要作用，促使胞外蛋白酶較早表達，有效防御病原菌侵入抵制感染［7]。Bi等［4]利用自殺性重組質(zhì)粒pJP-AhyR插入誘變嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因，構(gòu)建該基因突變株J-1△AhyR，證實AhyR基因與嗜水氣單胞菌致病因子表達有關(guān)。Kirke等［8]報道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白屬于LuxR型家族調(diào)控蛋白之一，AhyR基因能夠調(diào)節(jié)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶生成，與生物膜形成和細胞外蛋白酶產(chǎn)生有關(guān)。LuxR調(diào)控蛋白在革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中與自體誘導(dǎo)物（Autoinducers，AI）信號傳遞分子結(jié)合［12]，進一步調(diào)控細菌多種生理活動［4-9]。此外，細菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白PhoB、TraR與LuxR蛋白DNA結(jié)合域高度保守［13，14]。Shindoh等［13]認為大腸桿菌PhoB轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白DNA結(jié)合域與磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)激活基因調(diào)控有關(guān)。Vannini等［14]研究發(fā)現(xiàn)根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）TraR蛋白基因結(jié)合區(qū)位于DNA結(jié)合域和GAF/PAS結(jié)構(gòu)域之間。AhyR蛋白N端自體誘導(dǎo)物結(jié)合域為信號分子結(jié)合區(qū)域，C端DNA結(jié)合域能與目的基因特異性結(jié)合，以調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性［14，15]。本研究采用PCR方法擴增得到嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因序列，預(yù)測含有自體誘導(dǎo)物結(jié)合域和LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這與國外文獻報道［13，14]一致。此外還發(fā)現(xiàn)，以上兩個功能域為LuxR型家族調(diào)控蛋白獨有結(jié)構(gòu)域，有待于進行AhyR基因功能的生物學(xué)驗證。

圖7 AhyR蛋白片段3D模型的拉馬錢德蘭圖分析

細菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（如UhpA、AhyR、LuxR等）磷酸化參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡等生理病理過程，在感染致病過程中起重要調(diào)控作用［16-20]。因此，預(yù)測嗜水氣單胞菌AhyR蛋白的磷酸化位點有助于研究AhyR蛋白功能。Dahl等［18]研究大腸桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白UhpA磷酸化后，能夠結(jié)合到糖磷酸轉(zhuǎn)運蛋白UhpT啟動子，實現(xiàn)UhpT蛋白表達。Ottosen等［19]鑒定單純皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白5個磷酸化位點（18S、353S、375S、411S、452S），其中375S在VP16與Oct-1相互作用過程中發(fā)揮重要作用，這可能與病毒介導(dǎo)早期基因啟動及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關(guān)。Jeli?i?等［20]誘導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（Gal4）DNA結(jié)合域中7個絲氨酸位點突變，預(yù)測轉(zhuǎn)錄活性和與DNA結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)2個磷酸化位點（22S、85S），認為DNA結(jié)合域中的絲氨酸介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄機制中蛋白質(zhì)相互作用，從而穩(wěn)定激活子Gal4蛋白。本研究預(yù)測Zf1菌株AhyR蛋白含有13個磷酸化位點發(fā)現(xiàn)，173S、184T為酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位點。此外，對氣單胞屬AhyR蛋白序列比對，結(jié)果表明氨基酸序列同源性高于90%，系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白，這與鄭世超等［21]報道結(jié)果基本一致。進一步分析AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)，以及拉馬錢德蘭圖檢測表明AhyR基因推導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型合理，有助于進一步試驗驗證AhyR蛋白功能及其分子調(diào)控機制。

4 結(jié)論

獲得嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因大小為1 063 bp，推導(dǎo)編碼260 aa，發(fā)現(xiàn)含有自體誘導(dǎo)物結(jié)合域（PF03472）、LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PS50043）及13個磷酸化位點。AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)顯示LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域主要以α螺旋分布在C端外側(cè)，與拉馬錢德蘭圖檢測分析AhyR蛋白空間結(jié)構(gòu)基本一致。

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