解脂耶氏酵母誘變育種及發(fā)酵產(chǎn)α-酮戊二酸條件優(yōu)化

鞏健

（1. 淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，淄博 255314；2. 山東省曲霉應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，淄博 255314）

α-酮戊二酸是一種重要的有機酸，在代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物之一，也是合成多種氨基酸、蛋白質(zhì)的前體物質(zhì)［1]。作為營養(yǎng)強化劑，能有效降低術(shù)后患者和病人的機體損耗，在腦部可以作為酪氨酸和谷氨酸的前體，且能夠用于治療黃褐斑，清除自由基、延緩衰老［2]，在醫(yī)藥［3]、食品［4]、化工和化妝品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。隨著對α-酮戊二酸應(yīng)用價值的研究加深，市場對于其需求量在不斷增大。但是由于傳統(tǒng)的化學(xué)法合成α-酮戊二酸過程復(fù)雜，且在原料來源和生產(chǎn)過程中存在嚴(yán)重的安全問題，無法直接用于食品和藥品中［5]。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸逐漸成為新的研究方向。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有過量合成α-酮戊二酸的能力，并被美國食品藥品管理局認(rèn)為是安全的生產(chǎn)微生物，因此逐漸成為國內(nèi)外發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的研究熱點［6]。尤其是近年來，江南大學(xué)的陳堅教授及其研究團(tuán)隊在發(fā)酵產(chǎn)α-酮戊二酸的研究取得了重大的突破。2010年，在煉油廠附近的土壤中篩選出一株硫胺素營養(yǎng)缺陷型的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06，保藏編號CCTCC NO：M207143，該菌株在以甘油為碳源發(fā)酵條件下能夠產(chǎn)生39.2 g/L的α-酮戊二酸［7]。隨后，通過采用在該菌株內(nèi)過量表達(dá)丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase）的方法，改變碳代謝流，降低了副產(chǎn)物丙酮酸，同時提高了α-酮戊二酸的產(chǎn)量［8]。另外，又通過發(fā)酵條件的控制優(yōu)化，補加甘油和碳酸鈣，實現(xiàn)了66.2 g/L的α-酮戊二酸高產(chǎn)量［9]。

獲得具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的菌種，是發(fā)酵工業(yè)的核心資源。而誘變育種是進(jìn)行菌種選育的重要方法，發(fā)酵工業(yè)中正在使用的絕大部分高產(chǎn)優(yōu)良菌株都是采用誘變育種得到的。然而到目前為止，對于具有發(fā)酵產(chǎn)α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）誘變育種工作仍未見報道。因此，本研究以實驗室的一株解脂耶氏酵母ZY-4作為出發(fā)菌株，通過紫外線誘變和NTG化學(xué)誘變方法，篩選得到α-酮戊二酸產(chǎn)量提高的突變株，并對突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）硫胺素營養(yǎng)缺陷型菌株ZY-4，本實驗室保存。

種子培養(yǎng)基：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，若制固體培養(yǎng)基，加入20 g/L瓊脂粉。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.5 g/L，氯化銨 3.0 g/L，青霉素 0.05 g/L，制霉菌素 0.08 g/L， 硫胺素 10 μg/L，溴甲酚綠 1.0 g/L，瓊脂 20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 100 g/L，磷酸二氫鉀 1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.5 g/L，氯化銨 3.0 g/L，硫胺素5.0 μg/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備 BS-1E型振蕩培養(yǎng)箱，SWCJ-2D型超凈工作臺，TU-I901型紫外可見分光光度計，LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，HC-3018R型高速冷凍離心機，SHIMADZU LC-2010AHT型高效液相色譜。

1.2 方法

1.2.1 紫外線誘變處理 挑取一環(huán)保藏的Yarrowia lipolyticaZY-4接種至種子培養(yǎng)基，在30℃ 條件下200 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)48 h，進(jìn)行種子的活化。再以5%的接種量轉(zhuǎn)接后，每隔2 h測定菌液OD600值。取對數(shù)生長期菌液，4 500 r/min離心10 min收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，取5 mL菌懸液（105CFU/mL）加入直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，開啟15 W紫外燈預(yù)熱30 min后距離30 cm進(jìn)行紫外照射，照射時間分別為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s。在紅燈下，取照射后的菌液，用生理鹽水梯度稀釋后涂布種子培養(yǎng)基固體平板，同時以未照射的菌液為對照，置30℃避光培養(yǎng)48 h后，計算致死率。1.2.2 NTG誘變處理 將經(jīng)過紫外誘變篩選出的突變株培養(yǎng)到對數(shù)期，收集菌體并用pH6.0磷酸緩沖液洗滌兩次，取一定量的菌懸液（105CFU/mL），加入亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8以及1.0 mg/mL，30℃下振蕩培養(yǎng)20 min后，4 500 r/min離心10 min終止反應(yīng)，用pH6.0磷酸緩沖液洗滌3次并制成合適的稀釋度涂布種子培養(yǎng)基固體平板，30℃恒溫培養(yǎng)48 h后，計算致死率。

1.2.3 突變菌株篩選 初篩：誘變后的菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布于初篩培養(yǎng)基固體平板，30℃恒溫培養(yǎng)后，產(chǎn)α-酮戊二酸菌落周圍形成黃色變色圈，挑選生長旺盛、產(chǎn)酸快且變色圈與菌落直徑之比較大者作為初篩菌株。

復(fù)篩：挑取初篩產(chǎn)量較高的菌落，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃條件下200 r/min搖床恒溫培養(yǎng)3-5 d，每個菌落做3次平行，用HPLC測定發(fā)酵液中的α-酮戊二酸含量。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 碳源優(yōu)化：將篩選到的突變株培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，以5%的接種量分別接種至含有不同濃度葡萄糖（100、130、160及200 g/L）和甘油（2%、5%、8%、10%）為碳源的搖瓶，搖瓶中其他培養(yǎng)基成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

氮源濃度優(yōu)化：以甘油濃度8%為碳源，氯化銨濃度分別為（1.0、3.0、5.0、7.0 及10 g/L），其他成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

硫胺素濃度優(yōu)化：以甘油濃度8%為碳源，5.0 g/L氯化銨為氮源，硫胺素濃度分別為（1.0、3.0、5.0、7.0及9.0 μg/L），其他成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。

發(fā)酵條件：30℃條件下200 r/min搖床恒溫培養(yǎng)3-5 d，期間根據(jù)pH變化流加CaCO3。

1.2.5 分析方法 將待測發(fā)酵液于10 000 r/min條件下離心5 min后，取上清液進(jìn)行分析檢測。葡萄糖的測定使用3，5-二硝基水楊酸法［10]。甘油的測定使用改進(jìn)的滴定法［11]。α-酮戊二酸的測定采用高效液相色譜法（HPLC）［12]。

2 結(jié)果

2.1 紫外線誘變

2.1.1 誘變時間的確定 將解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4分別紫外線照射10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s后，30℃避光培養(yǎng)48 h計算致死率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ZY-4紫外線誘變致死率

由圖1可知，紫外線對解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4的致死效果在前20 s內(nèi)不明顯，20 s時僅達(dá)到 37.79%。30 s后致死率隨照射時間的延長而顯著增加，在50 s時達(dá)到91.29%，在60 s和70 s時紫外線的致死率分別為96.28% 和99.06%，致死效果十分明顯。本試驗紫外線對解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4菌懸液照射40 s時致死率為76.38%，易于發(fā)生提高產(chǎn)量的正向突變，因此，紫外線誘變的照射時間確定為40 s。

2.1.2 突變菌株篩選 紫外誘變菌株初篩：解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaZY-4菌懸液經(jīng)過紫外照射40 s后，稀釋并涂布于初篩平板培養(yǎng)，經(jīng)過觀察挑選出7株生長較快且變色圈與菌落直徑之比較大的突變菌株，進(jìn)行復(fù)篩試驗。

紫外誘變菌株復(fù)篩：對初篩得到的7株突變株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，通過HPLC測定發(fā)酵液中α-酮戊二酸產(chǎn)量，結(jié)果見表1。由表1可知，突變株7號的α-酮戊二酸產(chǎn)量較高，達(dá)到了18.1g/L，比原始出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了67.8%。

表1 紫外誘變菌株搖瓶發(fā)酵α-酮戊二酸產(chǎn)量

2.2 NTG誘變

2.2.1 誘變劑量的確定 為了進(jìn)一步提高菌株的α-酮戊二酸產(chǎn)量，同時減少單一誘變劑產(chǎn)生的疲勞效應(yīng)，對經(jīng)過紫外誘變選育得到的突變株7號又進(jìn)行了NTG誘變。加入亞硝基胍濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mg/mL，30℃條件下誘變20 min，去除誘變劑并培養(yǎng)48 h后計算致死率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 解脂耶氏酵母ZY-4紫外線誘變突變株7號經(jīng)亞硝基胍誘變致死率

由圖2可知，在亞硝基胍誘變過程中，隨著誘變劑量的增大，解脂耶氏酵母的死亡率明顯提高，NTG濃度為0.4 mg/mL時就達(dá)到67.48%，誘變劑量為1.0 mg/mL時致死率達(dá)到了93.77%。為了提高篩選效率，本研究采用1.0 mg/mL作為誘變劑NTG的最終濃度。

2.2.2 突變菌株篩選 NTG誘變菌株初篩：經(jīng)過紫外誘變后的突變株7號菌懸液使用濃度為1.0 mg/mL的NTG處理20 min，去除誘變劑后，稀釋并涂布于初篩平板培養(yǎng)，經(jīng)過觀察挑選出4株變色圈與菌落直徑之比較大的突變菌株，進(jìn)行復(fù)篩試驗。

NTG誘變菌株復(fù)篩：對初篩得到的4株突變株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，通過HPLC測定發(fā)酵液中α-酮戊二酸產(chǎn)量，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過亞硝基胍誘變育種后得到的4株突變株α-酮戊二酸產(chǎn)量均有提高，其中突 變株2號的α-酮戊二酸產(chǎn)量較高，達(dá)到了22.7g/L，比經(jīng)過紫外誘變得到的7號突變株產(chǎn)量提高了25.4%，比原始出發(fā)菌株ZY-4產(chǎn)量提高了110%。將經(jīng)過亞硝基胍誘變育種后得到的2號菌株，命名為解脂耶氏酵母YB-2。

表2 NTG誘變菌株搖瓶發(fā)酵α-酮戊二酸產(chǎn)量

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源優(yōu)化結(jié)果 分別以不同濃度葡萄糖（100、130、160以及200 g/L）和甘油（2%、5%、8%、10%）為碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較不同碳源對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產(chǎn)量影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 碳源對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產(chǎn)量影響

由圖3可知，不同濃度的葡萄糖和甘油作為碳源對解脂耶氏酵母的α-酮戊二酸產(chǎn)量均有影響。其中，以葡萄糖作為碳源時，葡萄糖濃度的增大對發(fā)酵液中α-酮戊二酸的積累影響較小。培養(yǎng)基中葡萄糖濃度由100 g/L增大一倍至200 g/L時，α-酮戊二酸的產(chǎn)量僅由22.6 g/L提高至28.4 g/L，提高了25.7%。相比之下使用甘油作為碳源，發(fā)酵液中積累的α-酮戊二酸隨著甘油濃度的增大變化明顯。當(dāng)甘油濃度為2%時，α-酮戊二酸產(chǎn)量為11.9 g/L。甘油濃度增大至5%和8%時，α-酮戊二酸產(chǎn)量分別達(dá)到22.4 g/L和30.6 g/L。繼續(xù)增大甘油濃度至10%，雖然α-酮戊二酸產(chǎn)量提高到32.3 g/L，但解脂耶氏酵母生長較慢，發(fā)酵周期延長。因此，本試驗最終確定使用8%濃度的甘油作為培養(yǎng)基碳源。

2.3.2 氮源優(yōu)化結(jié)果 α-酮戊二酸位于細(xì)胞碳—氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點，培養(yǎng)基中氮源濃度會對α-酮戊二酸的積累產(chǎn)生影響。以8%濃度的甘油作為碳源，分別以不同濃度氯化銨（1.0、3.0、5.0、7.0 及10 g/L）為氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，得到的α-酮戊二酸產(chǎn)量結(jié)果如圖4所示。

圖4 氮源氯化銨濃度對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產(chǎn)量影響

由圖4可知，培養(yǎng)基中過低（1.0 g/L）或過高（10 g/L）的NH4Cl均不利于α-酮戊二酸的積累，氮源的添加最佳濃度為5.0 g/L。當(dāng)?shù)陀?.0 g/L時，α-酮戊二酸濃度隨培養(yǎng)基中NH4Cl濃度的增加而不斷增加，當(dāng)NH4Cl濃度為5.0 g/L時，α-酮戊二酸濃度達(dá)到最大值（32.9 g/L）。但繼續(xù)增加NH4Cl濃度并不能繼續(xù)提高產(chǎn)生的α-酮戊二酸濃度，當(dāng)NH4Cl濃度高于5.0 g/L時，產(chǎn)生的α-酮戊二酸反而減少。

2.3.3 硫胺素優(yōu)化結(jié)果 由于解脂耶氏酵母突變株YB-2仍然是硫胺素營 養(yǎng)缺陷型，硫胺素作為限制性因素對α-酮戊二酸的積累有較大影響。以8%濃度的甘油作為碳源，5.0 g/L NH4Cl為氮源，比較不同硫胺素濃度（1.0、3.0、5.0、7.0及9.0 μg/L）條件下α-酮戊二酸產(chǎn)量影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 硫胺素濃度對解脂耶氏酵母突變株YB-2的α-酮戊二酸產(chǎn)量影響

由圖5可知，硫胺素濃度為1.0 μg/L時最有利于α-酮戊二酸的積累。隨著硫胺素濃度的增加，α-酮戊二酸的積累量逐漸減少。硫胺素濃度為1.0 μg/L時，能夠積累35.9 g/L的α-酮戊二酸，而當(dāng)培養(yǎng)基中添加的硫胺素濃度達(dá)到9.0 μg/L時，產(chǎn)生的α-酮戊二酸為30.5 g/L，僅是添加1.0 μg/L硫胺素時的85%。

3 討論

多年來，大量的研究者從許多方面對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸進(jìn)行了探索，例如，優(yōu)化培養(yǎng)基成分、優(yōu)化發(fā)酵條件、控制輔因子濃度，或者通過分子生物學(xué)方法過量表達(dá)參與代謝的酶等方法，嘗試提高發(fā)酵法合成α-酮戊二酸的產(chǎn)量［5]。這些方法從根本上來說分為兩類，一類是優(yōu)化發(fā)酵條件，另一類是選育具有更好生產(chǎn)性能的微生物菌種。菌種選育的方法主要是自然選育、誘變選育、原生質(zhì)體融合以及基因工程育種等方法。本研究采用了紫外線以及亞硝基胍誘變選育的方法，獲得了α-酮戊二酸的產(chǎn)量提高的解脂耶氏酵母YB-2，這是目前首次成功對產(chǎn)α-酮戊二酸的解脂耶氏酵母進(jìn)行誘變育種的報道。

本研究進(jìn)而對突變株YB-2的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初步優(yōu)化。使用甘油為碳源能夠得到比使用葡萄糖為碳源更高的α-酮戊二酸產(chǎn)量，最佳碳源確定為8%濃度的甘油，繼續(xù)提高甘油濃度會使得突變株YB-2生長速度減慢，積累α-酮戊二酸的時間延后。氮源NH4Cl濃度為5.0 g/L時最有利于α-酮戊二酸的的積累，這可能是由于當(dāng)NH4Cl濃度較低時，氮源成為解脂耶氏酵母生長代謝的限制性因素，此時增加氮源可以提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量。但當(dāng)NH4Cl濃度較高時，過量的NH4+被用來進(jìn)行氨基酸合成，因此TCA循環(huán)中間代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸被用來進(jìn)行谷氨酸合成代謝，從而降低了α-酮戊二酸的產(chǎn)量。較低的硫胺素濃度有利于α-酮戊二酸的積累，由于培養(yǎng)基中硫胺素濃度較低時，以硫胺素為輔因子的α-酮戊二酸脫氫酶KGDH和丙酮酸脫氫酶PDH活力大幅下降［1]，甘油經(jīng)過代謝后只能被氧化為丙酮酸和α-酮戊二酸，從而實現(xiàn)積累。

4 結(jié)論

（1）對解脂耶氏酵母進(jìn)行了紫外誘變選育，篩選到α-酮戊二酸產(chǎn)量提高的正突變株，達(dá)到了18.1 g/L，比原始出發(fā)菌株ZY-4產(chǎn)量提高了67.8%。

（2）對紫外誘變獲得的突變株又進(jìn)行了亞硝基胍誘變育種，并篩選到產(chǎn)量繼續(xù)提高的突變株YB-2，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到了22.7 g/L，比原始出發(fā)菌株ZY-4產(chǎn)量提高了110%。

（3）優(yōu)化了突變株YB-2的培養(yǎng)基成分，優(yōu)化后的培養(yǎng)基碳源使用8%的甘油，5.0 g/L NH4Cl為氮源，硫胺素濃度為1.0 μg/L，上述條件最有利于α-酮戊二酸的積累，優(yōu)化后α-酮戊二酸比原始出發(fā)菌株ZY-4產(chǎn)量提高了232.4%。

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