三種食源性致病菌的多重PCR快速檢測及應(yīng)用

余倩 黃夢娜

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣州 510225）

民以食為天，食以安為先。近年來食品安全問題的頻頻發(fā)生，給人民的日常生活帶來巨大的影響。目前影響食品安全的主要因素有：農(nóng)業(yè)化學控制物質(zhì)、農(nóng)藥殘留、食品添加劑、動植物天然毒素、真菌毒素、食源性致病菌和病毒［1]。

據(jù)世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年發(fā)生的食源性疾病病例數(shù)可達到10億［2]。如日本發(fā)生的腸出血性大腸桿菌O157H7中毒事件，最終導(dǎo)致萬人以上食物中毒［3]。據(jù)2004-2007年中國突發(fā)公共衛(wèi)生事件報告管理信息系統(tǒng)統(tǒng)計，由微生物引起的食物中毒事件為652起［4]。如2012年8月19日，百余名游客在三亞某酒店進餐后，食用了被沙門氏菌污染的蛋炒飯而引起食物中毒；2011年下半年，我國各大速凍食品廠的食品均被檢出金黃色葡萄球菌超標。由食源性致病菌引起的食品安全問題逐漸受到人民的關(guān)注與重視。

由于傳統(tǒng)的微生物檢測方法步驟繁瑣，消耗時間長，工作量大，限制了它的使用。分子生物學方法作為食品微生物學的主要檢測方法之一，在近幾年得到廣泛的運用，主要包括基因探針檢測方法、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等［5-8]。

PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），是從20世紀80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)，因具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點而在生物醫(yī)學領(lǐng)域中有較好的發(fā)展［9]。隨后又出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄PCR、實時PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR和不對稱PCR等，PCR技術(shù)也成為了分子生物學最重要的技術(shù)之一［10-12]。

本研究所采用的hilA基因為侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白基因，是沙門氏菌的毒力基因［13]。O157H7菌體抗原特異合成酶rfbE基因是參與O抗原脂多糖的生物合成基因，與Stx、eae、hlyA等其他毒力基因相比，特異性更強，所有O157H7菌體進行PCR都可擴增出該片段［14]。耐熱核酸酶nuc基因是目前檢測金黃色葡萄球菌重要的靶基因［15]。針對以上3個基因設(shè)計特異性引物，建立了可同時檢測3種病原菌的多重PCR方法，并對其在食品檢測方面的應(yīng)用進行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種名稱及編號，見表1。

表1 菌種名稱及編號

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)沙門菌的hilA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因，應(yīng)用Primer Premier 5.0分別設(shè)計如下3對特異性引物（表2），并送至生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2 食源性致病菌的培養(yǎng)和基因組DNA的提取 從保藏斜面中挑取合適的菌落置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，再以140的比例轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)液中37℃恒溫培養(yǎng)24 h進行活化。最后以140的比例移接至新的LB培養(yǎng)液中37℃恒溫振蕩培養(yǎng)2-4 h，至菌液OD600為0.7-1.0，用細菌DNA 提取試劑盒分別提取3種菌的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR反應(yīng)體系的建立 單重PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Taq酶0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板DNA溶液3 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，加去離子水至50 μL。

PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸 7 min。4℃保存。

1.2.4 多重PCR 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 將以上3對引物進行兩兩組合或三者混合，混合3種致病菌的基因組DNA作為模板進行PCR 反應(yīng)，驗證多重PCR反應(yīng)的特異性及引物之間的相互作用。調(diào)整反應(yīng)體系中的引物濃度和模板濃度等，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序同1.2.3。

1.2.5 人工模擬樣品的PCR檢測 分別制備沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的菌懸液，將3種培養(yǎng)液單獨接種鮮奶培養(yǎng)24 h，或任意兩兩等量混合然后取少量接種到鮮奶中培養(yǎng)24 h。對人工染菌的食品樣品先進行增菌，而后用試劑盒提取致病菌基因組DNA進行PCR檢測。以未染菌的食品作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 菌種及靶點在NCBI的編號

針對試驗所用的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌這3個菌種，及篩選確定出的靶基因，從NCBI網(wǎng)站上下載3種菌的基因組及其特異性靶點的序列。

表2 設(shè)計的引物匯總表

表3 菌種及靶點在NCBI上的編號

2.2 單重PCR反應(yīng)體系驗證結(jié)果

分別使用3種食源性致病菌所特有的特異性引物進行單重PCR反應(yīng)，均能擴增出與預(yù)計大小相符的目的條帶（圖1），且無非特異性條帶和二聚體；腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因287 bp；金黃色葡萄球菌的nuc基因354 bp；沙門氏菌的hilA基因468 bp；Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400 ng?；厥?個PCR產(chǎn)物進行測序，并在線與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)種的序列進行比對，比對結(jié)果顯示序列同源性均在99%以上。

圖1 單重PCR 反應(yīng)

2.3 PCR反應(yīng)特異性實驗

將3種致病菌的基因組DNA等量混合為模板，分別用一對引物進行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示腸出血性大腸桿菌O157H7引物只能擴增出腸出血性大腸桿菌O157H7中287 bp大小的條帶，沒有非特異性條帶和引物二聚體；金黃色葡萄球菌引物只能擴增出金黃色葡萄球菌的354 bp大小的條帶，無非特異性條帶和引物二聚體；同樣沙門氏菌引物也只能擴增出沙門氏菌468 bp大小的條帶，無其他非特異性條帶。這說明所設(shè)計的引物具有高度特異性。

2.4 多重PCR反應(yīng)體系的建立

分別將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌的基因組DNA等量混合為模板，按優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進行擴增，結(jié)果（圖2）顯示，雙重PCR反應(yīng)后在相應(yīng)大小位置處出現(xiàn)了兩條特異性條帶，三重PCR反應(yīng)后，在354、287和468 bp處分別出現(xiàn)了明顯的特異性目的條帶，且無非特異性條帶和引物二聚體的形成，Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400 ng。經(jīng)過多次試驗，確定多重PCR 的反應(yīng)體系為：（50 μL）：Taq酶0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板DNA溶液3 μL，引物（20 μmol/l）各1 μL，加去離子水至50 μL。

圖2 雙重、三重PCR 反應(yīng)

2.5 人工模擬樣品的PCR檢測

將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液單獨接種至鮮奶中或任意兩兩等量混合取少量接種至鮮奶中培養(yǎng)。經(jīng)增菌后提取致病菌基因組DNA進行PCR反應(yīng)，結(jié)果（圖3）顯示，未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應(yīng)致病菌的鮮奶均能檢測出對應(yīng)的特異性目的條帶，Marker和PCR產(chǎn)物的上樣量均為400 ng。以上結(jié)果說明本研究所建立的多重PCR檢測方法可應(yīng)用于食品中的腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌3種致病菌的檢測，且該方法均有較高的特異性。

3 討論

圖3 人工模擬樣品的PCR檢測

在經(jīng)濟發(fā)展的現(xiàn)代，健康成為人們越來越關(guān)注的問題，食品的安全問題成為社會關(guān)注的焦點。PCR快速檢測技術(shù)因為其特異性強和靈敏度高，操作簡單，消耗時間和試劑少，現(xiàn)已用于肝炎、艾滋病、皰疹病毒感染診斷［16]，也成為了食源性致病菌的重要檢驗方法之一。在PCR檢測技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重PCR技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于食品檢測方面。

目前用于檢測沙門氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv和16S rRNA，血清群特異性引物基因rfb基因和血清型特異性引物基因fliC、fljB和via基因等［13]。目前用于檢測腸出血性大腸桿菌O157：H7時，主要的毒力基因有：編碼志賀毒素stx1和stx2基因、編碼與細菌黏附作用有關(guān)的蛋白eaeA基因、編碼溶血素hly基因［14]。目前，用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SE的相關(guān)靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因［13]，以及編碼耐熱核酸酶基因nuc，編碼血漿凝固酶coa基因［15]。通過實驗，本研究所設(shè)計的沙門氏菌的引物hilA-f可有效擴增出468 bp的特異性基因片段，腸出血性大腸桿菌O157H7的引物rfbE-f可有效擴增出287 bp的特異性基因片段，金黃色葡萄球菌的引物nuc-f可有效擴增出354 bp的特異性基因片段，這3對引物可成功用于致病菌的多重PCR快速檢測，此前未見報道。

在食品中人工添加3種致病菌沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌，利用本實驗所設(shè)計的3對引物可成功的進行多重PCR的快速檢測。本研究所建立的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有較好的特異性，為食品中常見致病菌的檢測提供了一種快速、簡便、準確的方法，具有重要的理論意義及實踐意義。

同時多重PCR可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如熒光定量PCR相結(jié)合，可提高檢測效率。或是與其他檢測方法相結(jié)合，如基因芯片、實時PCR等，可以創(chuàng)造一個更完整的體系。

4 結(jié)論

本研究針對常見的3種食源性致病菌腸出血性大腸桿菌O157H7 的rfbE基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因及沙門氏菌的hilA基因，設(shè)計出相對應(yīng)的特異性引物，單重PCR結(jié)果顯示能擴增出與預(yù)計大小一致的片段，沒有非特異性擴增。使用設(shè)計的引物對人工感染的鮮奶進行檢測，結(jié)果表明未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應(yīng)致病菌的鮮奶均能檢測出對應(yīng)的特異性目的條帶。

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