褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌多樣性的初步分析

唐明等

摘要：褐飛虱是我國水稻生產(chǎn)中的重要害蟲，其唾液在取食過程中起著重要的作用。在筆者的前期研究中發(fā)現(xiàn)，褐飛虱在取食時會分泌凝膠狀唾液和水溶性唾液。筆者收集了褐飛虱的水溶性唾液分泌物，通過建立16S ribosomal DNA（rDNA）文庫檢測了唾液分泌物中的微生物組成，共發(fā)現(xiàn)6種細(xì)菌，它們都屬于變形菌門，其中屬于γ變形菌亞門、β變形菌亞門的分別有4種、2種。此外研究還對褐飛虱取食后殘留在水稻葉鞘中的口針鞘內(nèi)部進(jìn)行了透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在口針鞘內(nèi)部和周圍都有微生物的存在。研究結(jié)果可為進(jìn)一步認(rèn)識褐飛虱的取食行為以及褐飛虱體內(nèi)的細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)特性提供參考和依據(jù)。

關(guān)鍵詞：褐飛虱；唾液分泌物；細(xì)菌多樣性；細(xì)菌型共生菌

中圖分類號： S435.112+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0090-03

收稿日期：2013-08-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31201514）；貴州省科技基金（編號：黔科合J字[2012]2277號）；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費項目（編號：TZJF-2011年-39號）；貴陽市社會發(fā)展與民生科技項目（編號：筑科合同[2012103]85號）。

作者簡介：唐明（1979—），男，貴州遵義人，博士，講師，主要從事植物保護(hù)研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：tangming2006@hotmail.com。

通信作者：乙引，男，重慶合川人，博士，教授，主要植物生理生化研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：yiyin@gznu.edu.cn。褐飛虱又名稻褐虱[Nilaparvata lugens（Stl）]，屬同翅目（Homoptera）蟬亞目（Cicademorpha）飛虱科（Delphacidae）。褐飛虱是典型的刺吸式口器昆蟲，通過口針取食水稻韌皮部維管束中的汁液，因此褐飛虱是水稻生產(chǎn)中的重要害蟲，具有季節(jié)性、遷飛性、暴發(fā)性和猖獗性等特點，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。研究表明，褐飛虱取食過程包括口針穿刺和吸取汁液2個階段，其中穿刺過程在維管束外面的薄壁組織處進(jìn)行，口針刺入維管束后，褐飛虱分泌膠狀唾液并凝結(jié)形成口針鞘，由于口針每次刺入的方向不同，導(dǎo)致形成分叉狀的口針鞘；當(dāng)口針刺入維管束組織后，褐飛虱即停止口針穿刺和分泌膠狀唾液，通過口針鞘吸取汁液，這一階段褐飛虱分泌水溶性唾液，水溶性唾液具有很復(fù)雜的生物學(xué)功能，包括分泌降解植物細(xì)胞壁的酶、防止植物形成胼胝質(zhì)而阻塞維管束等[2-4]。

研究者對口針鞘的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，觀察到褐飛虱在分泌水溶性唾液的過程中，微生物通過褐飛虱口針鞘向水稻葉鞘內(nèi)部進(jìn)行傳播[4]。研究者推測，褐飛虱在對水稻取食的過程中，其體內(nèi)的微生物可能參與了取食過程并同時感染了水稻。昆蟲體內(nèi)的共生菌在昆蟲的生長、生殖以及植物病害的傳播等方面具有特殊的作用，是探討生命起源與進(jìn)化關(guān)系的理想模型[5]。褐飛虱體內(nèi)的真菌型的類酵母共生菌（yeast-like symbiote，YLS）對褐飛虱宿主有著重要的生理功能[6]，褐飛虱若缺乏類酵母類共生菌，其若蟲時期則明顯延長，若蟲成活率，雌成蟲體重、生長速率、產(chǎn)卵量明顯低于正常褐飛虱[7]。還有研究表明，褐飛虱田間種群的致害性與YLS的數(shù)量有關(guān)，水稻抗性品種對YLS的作用與褐飛虱種群對抗性品種的適應(yīng)性有關(guān)[8]。此外研究還發(fā)現(xiàn)，褐飛虱體內(nèi)也存在細(xì)菌型共生菌，研究者通過建立并分析褐飛虱細(xì)菌型共生菌的16S ribosomal DNA（rDNA）文庫發(fā)現(xiàn)，3個生物型的褐飛虱（生物型1、2、3）體內(nèi)有18種細(xì)菌型共生菌，這些共生菌在分類上屬于4個門（Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes），并且這18種共生菌的種類與生物型有一定的對應(yīng)關(guān)系[9]。此外還有一些研究也報道了褐飛虱體內(nèi)的細(xì)菌型共生菌[10-11]。但是關(guān)于褐飛虱細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)功能，以及細(xì)菌型共生菌與褐飛虱取食過程分泌的細(xì)菌微生物之間的關(guān)系等問題還有待研究。

為了研究褐飛虱在取食過程中分泌了哪些微生物進(jìn)入水稻，本試驗使用透射電子顯微鏡觀察褐飛虱取食后遺留在水稻葉鞘中的口針鞘；收集并濃縮了褐飛虱的唾液分泌物，以研究其中的細(xì)菌型微生物組成。研究將為進(jìn)一步認(rèn)識褐飛虱的取食行為及褐飛虱細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)特性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

生物型1的褐飛虱于2007年采種于位于杭州市的中國水稻研究所，在武漢大學(xué)遺傳研究所養(yǎng)蟲室的Taichung Native 1（TN1）水稻上進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，飼養(yǎng)條件為：平均溫度 28 ℃，平均光照16 h/d。

將TN1水稻種子用0.15%氯化汞消毒20 min，用無菌水洗6次，每次1 min；然后在無菌濾紙上濾干后用1/2 MS培養(yǎng)基在試管中進(jìn)行無菌苗的培養(yǎng)，每個試管接種1粒；待植株長到約3葉期（高10～15 cm）時，使用褐飛虱生物型1進(jìn)行取食，每株無菌苗平均接約20頭的4～5齡若蟲，取食時間 24 h；去掉植株上面的褐飛虱若蟲，將植株從培養(yǎng)基中拔出，去掉葉和根部，留下葉鞘組織作為透射電鏡觀察的樣品，以未放蟲取食的水稻葉鞘作為對照材料。

1.2褐飛虱唾液分泌物的收集

用2層拉伸的Parafilm（BEMIS）封住2側(cè)開口的圓柱形塑料容器（直徑約8 cm）的一側(cè)，在2層膜中間的夾層中加入約5 mL預(yù)先用0.22 μm濾膜過濾的2.5%蔗糖溶液，在瓶內(nèi)放入約200頭饑餓的褐飛虱，容器的另一側(cè)用紗網(wǎng)罩住，防止褐飛虱窒息和逃逸。然后將容器倒放，使褐飛虱停留在內(nèi)側(cè)的Parafilm膜上取食蔗糖溶液（取食過程中分泌水溶性唾液）。48h后用注射器收集蔗糖溶液，于-20 ℃保存。試驗重復(fù)數(shù)次，收集的蔗糖溶液用MAXI Dry Lyo凍干機（Heto-Holten）濃縮，通過升華作用使混合物脫水。將濃縮物于 -20 ℃ 保存。

1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對水稻進(jìn)行取食時，與水稻之間的相互作用機制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測到6種細(xì)菌型微生物。研究還對褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]程遐年，吳進(jìn)才，馬飛. 褐飛虱研究與防治[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：1-16.

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[10]王渭霞，羅舉，賴鳳香，等. 水稻褐飛虱內(nèi)生共生細(xì)菌Arsenophonus的鑒定和系統(tǒng)分析[J]. 昆蟲學(xué)報，2010，53（6）：647-654.

[11]李香香，楊焊，王志偉，等. 褐飛虱腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：126-129.

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1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對水稻進(jìn)行取食時，與水稻之間的相互作用機制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測到6種細(xì)菌型微生物。研究還對褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

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1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對水稻進(jìn)行取食時，與水稻之間的相互作用機制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測到6種細(xì)菌型微生物。研究還對褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

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