基于PCR—DGGE的中江丹參輪作期間土壤細(xì)菌遺傳多樣性變化特征

林貴兵等

摘要：為了解四川中江丹參輪作期間土壤細(xì)菌遺傳多樣性變化特征，分離提取土壤微生物DNA，以細(xì)菌通用引物PCR擴增，DGGE分離，切割條帶、回收并測序，在GenBank中查得菌種。結(jié)果表明，中江丹參輪作期間，土壤細(xì)菌主要群落包括：Alpha proteobacterium，Sphingomonas sp.，Uncultured bacterium isolate LH2-12，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h，Uncultured Arthrobacter sp.，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11，Uncultured Sphingomonas sp.。休種1年與當(dāng)年種植丹參土壤細(xì)菌多樣性相似，而與休種3年土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)有明顯差異；休種第2年屬于過渡。說明中江丹參輪作期休種為其土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性逐漸恢復(fù)平衡過程；且休地第2年是關(guān)鍵時期，與筆者前期采用培養(yǎng)法及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：丹參土壤細(xì)菌；PCR-DGGE；遺傳多樣性；變化特征

中圖分類號：S567.5+30.1；S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）04-0048-04

收稿日期：2013-08-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81173493）；國家科技支撐計劃（編號：2006BAI09B03-4）。

作者簡介：林貴兵（1981—），男，四川自貢人，博士，講師，研究方向為中藥資源可持續(xù)利用與藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。Tel：（0791）87118997；E-mail：linguibing897@gmail.com。

通信作者：嚴(yán)鑄云，博士。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。在中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）實施過程中，中藥材種植快速發(fā)展；但也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重的問題，如連作障礙。丹參忌連作，連作導(dǎo)致病蟲害嚴(yán)重，其質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降[1]。土壤生物環(huán)境惡化是引起作物連作障礙形成的主要機制之一[2]。研究結(jié)果表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與土傳病害、連作障礙有著密切的關(guān)系[3]；對地黃[4]、麥冬[5]和蒼術(shù)[6]研究認(rèn)為，土壤微生物群落失衡是引起連作障礙的主要因素之一。在前期的研究中，通過純培養(yǎng)法試驗發(fā)現(xiàn)，種植丹參的土壤中各類微生物數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，重新建立土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡；栽培丹參后土壤微生物群落自然恢復(fù)間隔至少為2年[7]。前期的研究方法主要是通過培養(yǎng)法研究土壤微生物群落，但此法只能對土壤中的可培養(yǎng)優(yōu)勢微生物進(jìn)行分析，而土壤中有絕大部分是不可培養(yǎng)微生物，因此培養(yǎng)法不能全面反映其微生物群落。本試驗以PCR-DGGE技術(shù)研究中江丹參栽培輪作休地期間其土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性變化特征，以揭示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在土壤微生物群落平衡自然恢復(fù)的變化特征，為丹參栽培地輪作期間土壤退化的修復(fù)以及緩解連作障礙提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試土壤基本情況

試驗區(qū)設(shè)在四川中江石泉鎮(zhèn)范圍內(nèi)，104°35′26″E，30°57′04″N，屬中亞熱帶濕潤氣候區(qū)；年平均氣溫16.5 ℃，年均降雨量1 200～1 400 mm；地形為臺地，地勢較平坦，面積 1 km2，土壤屬紅黃壤，海拔750 m。

2008年3月在試驗區(qū)范圍內(nèi)，選取丹參休種（現(xiàn)為油菜）1～4年的樣地，長寬在20 m×10 m以上；每一休種年選5塊樣地，丹參休種期間，為油菜-小麥的輪作體系；采用雙“S”法采樣與四分法取1.0 kg土壤，用牛皮紙袋裝好，帶回實驗室，在4 ℃下保存?zhèn)溆茫?月內(nèi)進(jìn)行土壤微生物分析。

1.2土壤微生物的解離

取土壤樣品2.0 g，加入20 g/L的偏磷酸鈉（pH值8.5，含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30），渦旋振蕩，離心，去上清液。

1.3土壤微生物DNA提取方法

參照文獻(xiàn)[8-11]，略作改良，具體如下：（1）取沉淀于SDS裂解液中渦旋；（2）68 ℃溫浴1 h，同時輕輕搖動，12 000 r/min 離心，取上清液體；（3）加入0.125倍體積的 5 mol/L 的醋酸鉀和0.42倍的40%的 PEG-8000；在-20 ℃下沉淀約15 min，12 000 r/min離心15 min，去上清液；（4）加入CTAB 提取液中溶解沉淀，68 ℃溫浴15 min，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕柔混均勻，12 000 r/min離心10 min；（5）在DNA上清液中加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，-20 ℃放置3 h以上，13 000 r/min離心20 min；（6）用70%乙醇洗DNA 2～3次，自然晾干，加無菌水溶解備用。

1.4DNA檢測

1.5PCR過程

3討論

本試驗采用PCR-DGGE技術(shù)研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化特征，結(jié)果表明，四川中江丹參種植和休種期間，其土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性發(fā)生了變化，導(dǎo)致土壤微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且在不同的丹參休種年限之間差異明顯，特別是在栽培丹參后休種第2年屬于過渡階段，是土壤細(xì)菌群落失衡恢復(fù)的重要時期。這對采用改良土壤微生態(tài)環(huán)境以緩解丹參連作障礙有重要的實用指導(dǎo)價值，有利于揭示丹參連作障礙形成關(guān)鍵因素。

PCR-DGGE法研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有快速、可重復(fù)性等優(yōu)點，在近幾年來研究土壤微生物生態(tài)等領(lǐng)域研究上得到廣泛應(yīng)用，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法培養(yǎng)微生物種群局限性的缺點，能對土壤中不可培養(yǎng)的微生物菌群進(jìn)行研究[16]。但是，本技術(shù)依賴于對土壤微生物DNA提取技術(shù)和PCR技術(shù)，因此DNA提取的土壤微生物菌群的全面性和PCR擴增的引物、擴增條件優(yōu)化等因素對DGGE分離菌群豐富度具有至關(guān)重要的影響。

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