甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性多克隆抗體的親和純化

賀江　劉賢金

摘要：采用碳二亞胺法將甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原與瓊脂糖凝膠進行鏈接，并利用鏈接產(chǎn)物對相應的多克隆抗血清進行純化。經(jīng)鑒定，偶聯(lián)反應正常，純化效果良好且產(chǎn)率約為78.5%；純化后抗體能夠保持對5種農(nóng)藥對象的識別活性，且具有更高的親和活性。應用純化后的抗體能夠建立起更靈敏的免疫檢測方法。

關(guān)鍵詞：親和純化；甲氧基有機磷農(nóng)藥；廣譜特異性抗體；免疫分析

中圖分類號： TQ450.7 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0033-03

收稿日期：2013-08-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：30871658）。

作者簡介：賀江（1983—），男，江西萍鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)研究。E-mail：hejiang1119@163.com。農(nóng)藥殘留作為食品安全問題中的重要方面之一，深受世界各國的普遍關(guān)注。建立有效的農(nóng)藥殘留監(jiān)測體系是對農(nóng)藥殘留問題進行控制的前提與基礎，目前公認的理想農(nóng)藥殘留監(jiān)測體系包括以農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)作為現(xiàn)場初篩工具、以農(nóng)藥殘留檢測標準方法作為最終的定性定量確證工具[1]。免疫檢測技術(shù)是一種簡單、快速且靈敏的檢測方法，已被廣泛用于農(nóng)藥殘留的快速檢測[2-6]。抗體的特異性和親和力等特性是決定這類方法檢測效果的核心因素。基于動物免疫的多克隆抗體[6-7]、基于雜交瘤技術(shù)的單克隆抗體[2，8]以及基于噬菌體展示等分子技術(shù)的重組抗體[9-10]等均已在農(nóng)藥免疫殘留檢測領(lǐng)域有應用，但無論利用哪類抗體進行免疫分析都存在一些會影響檢測效果的干擾物質(zhì)。例如，在多克隆抗血清中存在非特異性或者低親和力免疫球蛋白；雜交瘤細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中存在白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等宿主蛋白；而重組抗體中往往也同樣存在來自于宿主（如大腸桿菌）的各類蛋白。因此，在建立特異性強、檢測限低、線性范圍廣的免疫檢測技術(shù)時，往往需要結(jié)合抗體純化過程來實現(xiàn)[11-13]。對抗體進行純化的方法很多，其中親和層析技術(shù)應用最廣泛。關(guān)于應用親和層析技術(shù)對抗體進行純化的研究，已有學者進行了深度的概述[14-16]?？贵w親和純化效果主要取決于親和層析柱上所固定的配體?；贏蛋白和G蛋白的抗體親和純化技術(shù)研究引用最廣泛，除此之外，基于組氨酸、金屬離子、植物凝集素等新型配體的親和層析技術(shù)也同樣被應用于抗體的純化。然而，直接應用固相抗原進行相應抗體的親和純化無疑是最有效的方法，尤其是對多克隆抗血清而言。筆者所在的課題組前期合成了甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原，并進一步免疫了新西蘭大白兔，從而獲得了針對這類農(nóng)藥的廣譜特異性抗體[17]。本研究擬在此基礎上偶聯(lián)通用半抗原至瓊脂糖固相載體制備親和層析柱，并進一步應用于抗血清的純化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體（兔血清）、甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原、通用半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物（Hapten-OVA）等由筆者所在的實驗室自行制備保存；碳二亞胺縮合劑99% 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）購自百靈威科技有限公司；氨基活化的瓊脂糖凝膠（EAH 瓊脂糖凝膠 4B）購自通用電氣醫(yī)療集團；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等購自Sigma公司；30～200 ku 蛋白Marker購自北京全式金生物有限公司；HRP標記的羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等農(nóng)藥標準品（99.9%）購自中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent G6410A型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI離子源）；DYY-31A 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、微型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；微量紫外可見分光光度計（通用電氣醫(yī)療集團）；MK2酶標儀、全自動洗板機（Thermo Fisher）；其他實驗室常規(guī)儀器設備。

1.3方法

1.3.1甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原免疫親和柱的制備以EDC·HCl為偶聯(lián)劑，采用碳二亞胺法將帶有羧基活性基團的甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原與帶有氨基活性基團的EAH 瓊脂糖凝膠 4B 凝膠鏈接，反應原理如圖1所示。取EAH 瓊脂糖凝膠 4B 5 mL，用超純水（pH值 4.5）和 0.5 mol/L NaCl 各交替洗滌3次；同時用5 mL 連接反應液（50% 甲醇，pH 值4.5）溶解10.0 mg 通用半抗原；然后將二者混合，于冰浴中緩慢振搖反應，反應前1 h 分10 次加入EDC 溶液至終濃度為0.1 mol/L；冰浴中反應過夜，將溫度逐漸升高至室溫，總反應時間為24 h。反應結(jié)束后，用0.1 mol/L 醋酸緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 4.0）和0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 8.0）交替洗滌連接產(chǎn)物各3次，最后用體積分數(shù)為50%的甲醇洗滌，并裝填成 1 mL 的親和柱備用。對照反應中不加EDC，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的選擇離子監(jiān)測模式（selective ion monitoring，SIM）測定反應后半抗原與副產(chǎn)物的量，進而判斷反應是否順利進行。

1.3.2甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的親和純化甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體經(jīng)飽和硫酸銨法初步純化，

再用自制的通用半抗原免疫親和柱進一步純化。親和純化具體過程如下：以10 mL 結(jié)合緩沖液平衡親和柱；加入1 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的粗提抗體樣品，用結(jié)合緩沖液洗滌至流出液中無蛋白檢出；以4 mL 洗脫緩沖液洗脫目的抗體，并用加有中和緩沖液的小管收集；最后用5 mL 結(jié)合緩沖液洗滌親和柱。純化結(jié)束后，通過不連續(xù)體系非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定純化效果，間接非競爭ELISA測定抗體純化后的活性。SDS-PAGE電泳操作過程參照相關(guān)試驗手冊。間接非競爭ELISA操作過程如下：（1）包被。用CBS緩沖液將Hapten-OVA包被原稀釋至2 μg/mL后加于96孔板中，100 μL/孔，4 ℃過夜。（2）封閉。用PBST洗板3次，加入200 μL/孔封閉液（含2% OVA的PBS溶液），37 ℃孵育 1 h。（3）加樣。用PBST洗板3次，將純化后的抗體樣品用PBS適當稀釋后再加入微孔中，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。（4）加酶標二抗。用含2% OVA的PBS液將酶標二抗稀釋 5 000 倍（工作濃度），100 μL/孔，37 ℃溫浴1 h。（5）顯色。加入TMB底物液100 μL/孔，顯色15 min，再加入50 μL/孔濃度為 2 mol/L的 H2SO4快速終止反應，最后用酶標儀讀取D450 nm。每個樣品重復3個孔。

1.3.3抗體純化前后的特異性和親和力比較采用間接競爭ELISA鑒定純化后抗體對馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等甲氧基有機磷農(nóng)藥的反應活性，并與純化前抗體的反應活性進行比較，以判定純化過程對抗體廣譜特異性的影響。先用Hapten-OVA包被原包被并用OVA封閉96孔板，然后加入純化抗體和不同濃度的農(nóng)藥標準溶液進行競爭結(jié)合，后續(xù)加酶標二抗、顯色等過程同前。計算純化抗體對各種農(nóng)藥對象的半抑制濃度（IC50），并以馬拉硫磷為基準計算交叉反應率。

2結(jié)果與分析

2.1甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原免疫親和柱的制備

由偶聯(lián)反應機理可知，隨著反應的進行，反應體系中的半抗原逐漸消耗，而同時伴隨著脲類副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，試驗中通過采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）中的選擇離子監(jiān)測模式測定反應后半抗原與副產(chǎn)物的量，進而判斷反應能否順利進行。測定結(jié)果表明，反應結(jié)束后偶聯(lián)體系中的半抗原（[M+H]=231.0）的量顯著少于對照體系，同時偶聯(lián)體系中有大量副產(chǎn)物（[M+H]=1742）產(chǎn)生，說明半抗原分子與固相載體偶聯(lián)成功，經(jīng)計算偶聯(lián)效率約為60%。偶聯(lián)小分子化合物至固相載體的過程在合成化學中相對比較成熟，有研究認為，在應用此類反應時往往只是直接反應，而對反應是否發(fā)生不進行監(jiān)控[18]。本研究所采用的鑒定方法較簡單有效，可為相關(guān)學者提供參考。

2.2甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的親和純化

將上述連接產(chǎn)物裝填成1 mL 的親和柱，用于甲氧基有機磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的純化。收集純化過程中各步驟樣品分別采用不連續(xù)體系的非變性SDS-PAGE 電泳和直接非競爭ELISA 進行純度和活性鑒定。SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，廣譜特異性抗體純化效果良好（圖2-a），并對樣品純化前后的體積和蛋白濃度進行計算，得到純化產(chǎn)率約為78.5%。將各部分樣品的蛋白濃度調(diào)為一致進行直接非競爭ELISA，結(jié)果顯示，純化后抗體的D450 nm略高于純化前的樣品，而純化洗滌液的D450 nm較?。▓D2-b）。說明親和純化過程能夠?qū)⒁恍┑陀H和力的抗體去除，而高親和力的抗體能夠保留下來。抗體純化效果主要受洗滌液的類型、體積和流速等條件影響，本研究采用典型的洗滌條件進行抗體純化，獲得了較好的純化效果。

2.3抗體純化前后的特異性和親和力

筆者所在的課題組前期研究結(jié)果表明，所用廣譜特異性抗體能夠識別馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等一系列甲氧基有機磷農(nóng)藥。因此，本試驗進一步鑒定了純化后的抗體對上述農(nóng)藥的識別活性，并與純化前進行比較，結(jié)果如表1所示。純化后，廣譜特異性抗體對樂果的交叉反應率略變大，而對稻豐散、亞胺硫磷和殺撲磷的交叉反應率有所減小?？赡芤驗樵诩兓^程中去除的低親和力抗體主要是特異識別這3種對象的。但總體而言，經(jīng)過純化后的抗體依然能夠識別上述5種甲氧基有機磷農(nóng)藥，并且其IC50比純化前更低。這說明純化后的抗體對這些農(nóng)藥的親和力有所增強，能夠建立起更靈敏的檢測方法。

3結(jié)論

本研究成功地將甲氧基有機磷農(nóng)藥通用半抗原偶聯(lián)至固相載體中制備成親和純化柱，并應用其對甲氧基有機磷農(nóng)藥抗血清進行了親和純化。經(jīng)鑒定，親和純化效果良好，純化產(chǎn)率約為78.5%；純化后抗體的親和活性有所增強，而其對馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等農(nóng)藥對象的交叉反應性未受影響。

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