大麻ISSR引物的篩選與細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的優(yōu)化

張利國(guó)等

摘要：在穩(wěn)定的ISSR-PCR擴(kuò)增條件下，使用50個(gè)大麻ISSR引物對(duì)代表性的大麻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出14個(gè)適合大麻的ISSR引物；同時(shí)，為優(yōu)化大麻染色體的制片質(zhì)量，對(duì)大麻染色體制片過(guò)程中的變溫預(yù)處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術(shù)與方法進(jìn)行了試驗(yàn)，優(yōu)化后的大麻染色體制片條件為：芽長(zhǎng)達(dá)1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長(zhǎng)24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應(yīng)的引物篩選與染色體制片技術(shù)的優(yōu)化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術(shù)

中圖分類號(hào)： S563.303 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（編號(hào)：2013RFQYJ014）。

作者簡(jiǎn)介：張利國(guó)（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學(xué)研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國(guó)，大麻纖維公元前8世紀(jì)即有應(yīng)用，是人類歷史上最早應(yīng)用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫(yī)藥上都有廣泛用途。國(guó)內(nèi)主要是應(yīng)用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無(wú)靜電等特點(diǎn)，且具有極強(qiáng)的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)[2]，給大麻的種質(zhì)鑒定、擴(kuò)大栽培等帶來(lái)不便。

ISSR可以在沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下，進(jìn)行基因組指紋圖譜的構(gòu)建。ISSR引物較長(zhǎng)，因而對(duì)PCR反應(yīng)的敏感性低于RAPD，穩(wěn)定勝優(yōu)于RAPD，具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性[3-5]。針對(duì)目前大麻遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱、相關(guān)的SSR引物并未開發(fā)的現(xiàn)狀，ISSR標(biāo)記技術(shù)是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標(biāo)記可重復(fù)性明顯優(yōu)于RAPD，但不如細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直觀和穩(wěn)定，而細(xì)胞學(xué)的核型資料在種內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，直觀性好，說(shuō)服力強(qiáng)，同時(shí)在研究植物的起源與進(jìn)化上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。綜合利用細(xì)胞遺傳學(xué)和 ISSR 技術(shù)來(lái)研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對(duì)于不同植物，其染色體壓片技術(shù)中的處理手段與處理時(shí)間各不相同。目前傳統(tǒng)的大麻制片方法是通過(guò)對(duì)二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學(xué)藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學(xué)藥劑，容易產(chǎn)生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態(tài)上的扭曲等現(xiàn)象，不利于熒光原位雜交等后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，如果操作不當(dāng)，易誘發(fā)人的細(xì)胞染色體突變，對(duì)長(zhǎng)期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來(lái)直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應(yīng)體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時(shí)采用日本京都大學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)家遠(yuǎn)藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結(jié)合大麻作物特點(diǎn)，優(yōu)化大麻染色體制片條件。研究結(jié)果將為從細(xì)胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進(jìn)化提供研究基礎(chǔ)，兩方面互相補(bǔ)充，將會(huì)有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學(xué)最新公布的50條引物。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應(yīng)體系各因素及梯度設(shè)計(jì)見表1。

3.2細(xì)胞學(xué)制片優(yōu)化

制片的關(guān)鍵在于根尖材料的處理。本試驗(yàn)通過(guò)變溫處理來(lái)提高根尖細(xì)胞的分裂指數(shù)，在21 ℃萌發(fā)后轉(zhuǎn)到8 ℃條件下培養(yǎng)40 h，再轉(zhuǎn)到23 ℃下培養(yǎng)24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會(huì)稍有變化，可隨時(shí)壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長(zhǎng)最旺盛的時(shí)候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過(guò)抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進(jìn)入中期的染色體均被阻遏而不進(jìn)入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗(yàn)采用24 h低溫處理，染色體長(zhǎng)度適中，形態(tài)良好。在處理的過(guò)程中一定保證冰水混合物的狀態(tài)；并且處理時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致染色體高度濃縮，不利于進(jìn)一步分析。低溫處理的方法簡(jiǎn)便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個(gè)制片過(guò)程中沒(méi)有使用化學(xué)藥劑，所以不會(huì)出現(xiàn)污染和因?yàn)榍疤幚懋a(chǎn)生異常分裂現(xiàn)象，可為原位雜交等后續(xù)技術(shù)在大麻研究上的應(yīng)用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

大麻ISSR引物的篩選和高質(zhì)量細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的優(yōu)化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎(chǔ)，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

參考文獻(xiàn)：

[1]關(guān)鳳芝. 大麻遺傳育種與栽培技術(shù)[M]. 哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[2]張利國(guó)，關(guān)鳳芝，吳廣文，等. 基于核型與RAPD標(biāo)記的大麻地方品種遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2009，31（3）：169-172，181.

[3]陶愛芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及兩種方法結(jié)合在分析黃麻屬起源與演化上的比較[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：2277-2284.

[4]汪斌，祁偉，蘭濤，等. 應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記繪制紅麻種質(zhì)資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（6）：1116-1123.

[5]張明，李延龍. 基于ISSR標(biāo)記的韭菜種質(zhì)資源遺傳多樣性初探[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（1）：146-150.

[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.

[7]辛培堯.大麻染色體行為分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（11）：2189-2193.

摘要：在穩(wěn)定的ISSR-PCR擴(kuò)增條件下，使用50個(gè)大麻ISSR引物對(duì)代表性的大麻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出14個(gè)適合大麻的ISSR引物；同時(shí)，為優(yōu)化大麻染色體的制片質(zhì)量，對(duì)大麻染色體制片過(guò)程中的變溫預(yù)處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術(shù)與方法進(jìn)行了試驗(yàn)，優(yōu)化后的大麻染色體制片條件為：芽長(zhǎng)達(dá)1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長(zhǎng)24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應(yīng)的引物篩選與染色體制片技術(shù)的優(yōu)化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術(shù)

中圖分類號(hào)： S563.303 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（編號(hào)：2013RFQYJ014）。

作者簡(jiǎn)介：張利國(guó)（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學(xué)研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國(guó)，大麻纖維公元前8世紀(jì)即有應(yīng)用，是人類歷史上最早應(yīng)用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫(yī)藥上都有廣泛用途。國(guó)內(nèi)主要是應(yīng)用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無(wú)靜電等特點(diǎn)，且具有極強(qiáng)的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)[2]，給大麻的種質(zhì)鑒定、擴(kuò)大栽培等帶來(lái)不便。

ISSR可以在沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下，進(jìn)行基因組指紋圖譜的構(gòu)建。ISSR引物較長(zhǎng)，因而對(duì)PCR反應(yīng)的敏感性低于RAPD，穩(wěn)定勝優(yōu)于RAPD，具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性[3-5]。針對(duì)目前大麻遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱、相關(guān)的SSR引物并未開發(fā)的現(xiàn)狀，ISSR標(biāo)記技術(shù)是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標(biāo)記可重復(fù)性明顯優(yōu)于RAPD，但不如細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直觀和穩(wěn)定，而細(xì)胞學(xué)的核型資料在種內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，直觀性好，說(shuō)服力強(qiáng)，同時(shí)在研究植物的起源與進(jìn)化上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。綜合利用細(xì)胞遺傳學(xué)和 ISSR 技術(shù)來(lái)研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對(duì)于不同植物，其染色體壓片技術(shù)中的處理手段與處理時(shí)間各不相同。目前傳統(tǒng)的大麻制片方法是通過(guò)對(duì)二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學(xué)藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學(xué)藥劑，容易產(chǎn)生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態(tài)上的扭曲等現(xiàn)象，不利于熒光原位雜交等后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，如果操作不當(dāng)，易誘發(fā)人的細(xì)胞染色體突變，對(duì)長(zhǎng)期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來(lái)直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應(yīng)體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時(shí)采用日本京都大學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)家遠(yuǎn)藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結(jié)合大麻作物特點(diǎn)，優(yōu)化大麻染色體制片條件。研究結(jié)果將為從細(xì)胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進(jìn)化提供研究基礎(chǔ)，兩方面互相補(bǔ)充，將會(huì)有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學(xué)最新公布的50條引物。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應(yīng)體系各因素及梯度設(shè)計(jì)見表1。

3.2細(xì)胞學(xué)制片優(yōu)化

制片的關(guān)鍵在于根尖材料的處理。本試驗(yàn)通過(guò)變溫處理來(lái)提高根尖細(xì)胞的分裂指數(shù)，在21 ℃萌發(fā)后轉(zhuǎn)到8 ℃條件下培養(yǎng)40 h，再轉(zhuǎn)到23 ℃下培養(yǎng)24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會(huì)稍有變化，可隨時(shí)壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長(zhǎng)最旺盛的時(shí)候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過(guò)抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進(jìn)入中期的染色體均被阻遏而不進(jìn)入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗(yàn)采用24 h低溫處理，染色體長(zhǎng)度適中，形態(tài)良好。在處理的過(guò)程中一定保證冰水混合物的狀態(tài)；并且處理時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致染色體高度濃縮，不利于進(jìn)一步分析。低溫處理的方法簡(jiǎn)便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個(gè)制片過(guò)程中沒(méi)有使用化學(xué)藥劑，所以不會(huì)出現(xiàn)污染和因?yàn)榍疤幚懋a(chǎn)生異常分裂現(xiàn)象，可為原位雜交等后續(xù)技術(shù)在大麻研究上的應(yīng)用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

大麻ISSR引物的篩選和高質(zhì)量細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的優(yōu)化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎(chǔ)，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

參考文獻(xiàn)：

[1]關(guān)鳳芝. 大麻遺傳育種與栽培技術(shù)[M]. 哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[2]張利國(guó)，關(guān)鳳芝，吳廣文，等. 基于核型與RAPD標(biāo)記的大麻地方品種遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2009，31（3）：169-172，181.

[3]陶愛芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及兩種方法結(jié)合在分析黃麻屬起源與演化上的比較[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：2277-2284.

[4]汪斌，祁偉，蘭濤，等. 應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記繪制紅麻種質(zhì)資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（6）：1116-1123.

[5]張明，李延龍. 基于ISSR標(biāo)記的韭菜種質(zhì)資源遺傳多樣性初探[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（1）：146-150.

[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.

[7]辛培堯.大麻染色體行為分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（11）：2189-2193.

摘要：在穩(wěn)定的ISSR-PCR擴(kuò)增條件下，使用50個(gè)大麻ISSR引物對(duì)代表性的大麻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出14個(gè)適合大麻的ISSR引物；同時(shí)，為優(yōu)化大麻染色體的制片質(zhì)量，對(duì)大麻染色體制片過(guò)程中的變溫預(yù)處理、低溫提高中期分裂相的方法及解離等具體技術(shù)與方法進(jìn)行了試驗(yàn)，優(yōu)化后的大麻染色體制片條件為：芽長(zhǎng)達(dá)1 cm后（21 ℃），23 ℃ 條件下促芽生長(zhǎng)24 h，再低溫（0 ℃）處理24 h，37 ℃解離20 min（20 g/L纖維素酶和20 g/L果膠酶）。適合大麻ISSR-PCR反應(yīng)的引物篩選與染色體制片技術(shù)的優(yōu)化，將為大麻遺傳多樣性的多層次化分析提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ISSR引物；大麻；染色體；制片技術(shù)

中圖分類號(hào)： S563.303 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0030-03

收稿日期：2013-08-13

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：QC2012C115）；黑龍江省哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（編號(hào)：2013RFQYJ014）。

作者簡(jiǎn)介：張利國(guó)（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，助理研究員，從事麻類分子育種學(xué)研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

通信作者：張效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我國(guó)，大麻纖維公元前8世紀(jì)即有應(yīng)用，是人類歷史上最早應(yīng)用的纖維作物[1]，目前在紡織、建筑和醫(yī)藥上都有廣泛用途。國(guó)內(nèi)主要是應(yīng)用大麻纖維，大麻纖維具有吸濕、透氣、殺菌抑菌、無(wú)靜電等特點(diǎn)，且具有極強(qiáng)的抗紫外線功能，已成為重要的軍用紡織品原料。由于大麻是雌雄異株作物，遺傳資源極容易混雜，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)[2]，給大麻的種質(zhì)鑒定、擴(kuò)大栽培等帶來(lái)不便。

ISSR可以在沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下，進(jìn)行基因組指紋圖譜的構(gòu)建。ISSR引物較長(zhǎng)，因而對(duì)PCR反應(yīng)的敏感性低于RAPD，穩(wěn)定勝優(yōu)于RAPD，具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性[3-5]。針對(duì)目前大麻遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱、相關(guān)的SSR引物并未開發(fā)的現(xiàn)狀，ISSR標(biāo)記技術(shù)是從分子水平研究大麻遺傳分化較合適的方法。ISSR標(biāo)記可重復(fù)性明顯優(yōu)于RAPD，但不如細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直觀和穩(wěn)定，而細(xì)胞學(xué)的核型資料在種內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，直觀性好，說(shuō)服力強(qiáng)，同時(shí)在研究植物的起源與進(jìn)化上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。綜合利用細(xì)胞遺傳學(xué)和 ISSR 技術(shù)來(lái)研究大麻遺傳多樣性，將有效地克服單一方法存在的局限，從各自的角度提供種間分化信息。

對(duì)于不同植物，其染色體壓片技術(shù)中的處理手段與處理時(shí)間各不相同。目前傳統(tǒng)的大麻制片方法是通過(guò)對(duì)二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙堿[7]等化學(xué)藥劑的作用，使染色體分裂相盡可能地停留在中期，但由于使用了化學(xué)藥劑，容易產(chǎn)生染色體的異常分裂、染色體斷片、丟失、形態(tài)上的扭曲等現(xiàn)象，不利于熒光原位雜交等后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，如果操作不當(dāng)，易誘發(fā)人的細(xì)胞染色體突變，對(duì)長(zhǎng)期制片工作者具有一定的損害。此外，這些方法在操作上效果有限，獲得大量中期分裂相難度較大，給大麻染色體分析帶來(lái)直接困難。

本研究在建立大麻ISSR-PCR反應(yīng)體系的條件下，篩選出適合大麻的ISSR引物；同時(shí)采用日本京都大學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)家遠(yuǎn)藤教授的植物染色體制片方法（該方法在小麥、亞麻、苧麻等作物上都取得了良好效果），結(jié)合大麻作物特點(diǎn)，優(yōu)化大麻染色體制片條件。研究結(jié)果將為從細(xì)胞和分子水平綜合分析大麻遺傳起源、進(jìn)化提供研究基礎(chǔ)，兩方面互相補(bǔ)充，將會(huì)有效克服單一方法存在的局限。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料黑龍江大麻地方品種Wuchang40以及代表性大麻資源K-16、K-20由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。ISSR分析采用哥倫比亞大學(xué)最新公布的50條引物。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1篩選適合大麻的ISSR引物在前期工作中，反應(yīng)體系各因素及梯度設(shè)計(jì)見表1。

3.2細(xì)胞學(xué)制片優(yōu)化

制片的關(guān)鍵在于根尖材料的處理。本試驗(yàn)通過(guò)變溫處理來(lái)提高根尖細(xì)胞的分裂指數(shù)，在21 ℃萌發(fā)后轉(zhuǎn)到8 ℃條件下培養(yǎng)40 h，再轉(zhuǎn)到23 ℃下培養(yǎng)24 h。不同大麻品種變溫處理具體要求可能會(huì)稍有變化，可隨時(shí)壓片鏡檢確定，原則上也就是在根尖生長(zhǎng)最旺盛的時(shí)候取材。

冰水混合物（低溫冷處理）的作用是通過(guò)抑制微管蛋白組裝成紡錘絲，因此凡進(jìn)入中期的染色體均被阻遏而不進(jìn)入分裂后期，這樣就可以累積大量的處于分裂中期的染色體。

本試驗(yàn)采用24 h低溫處理，染色體長(zhǎng)度適中，形態(tài)良好。在處理的過(guò)程中一定保證冰水混合物的狀態(tài)；并且處理時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致染色體高度濃縮，不利于進(jìn)一步分析。低溫處理的方法簡(jiǎn)便易行，獲得的中期分裂相較多，效果良好，而且由于在整個(gè)制片過(guò)程中沒(méi)有使用化學(xué)藥劑，所以不會(huì)出現(xiàn)污染和因?yàn)榍疤幚懋a(chǎn)生異常分裂現(xiàn)象，可為原位雜交等后續(xù)技術(shù)在大麻研究上的應(yīng)用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

大麻ISSR引物的篩選和高質(zhì)量細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的優(yōu)化，將為多層次、多角度研究大麻遺傳信息奠定基礎(chǔ)，包括研究大麻遺傳多樣性、物種起源和遺傳演化等。

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