全內反射測速技術（TIRV）中界面隱失波基準光強I0的確定

史 飛，鄭 旭，陳榮前，李戰(zhàn)華

（1.中國計量學院計量測試工程學院，杭州 310018；2.中國科學院力學研究所，北京 100190）

全內反射測速技術（TIRV）中界面隱失波基準光強I0的確定

史 飛1，鄭 旭2，陳榮前1，李戰(zhàn)華2

（1.中國計量學院計量測試工程學院，杭州 310018；2.中國科學院力學研究所，北京 100190）

基于隱失波全內反射的測速技術TIRV（Total internal reflection velocimetry）是微納流動中測量壁面附近幾百納米范圍內速度的有效方法。隱失波的光強分布I（z）隨離開壁面的高度z指數衰減。若熒光粒子位于光強分布中，其亮度也將符合此指數關系，通過測量粒子亮度可確定粒子的垂向位置z，而確定隱失波的基準光強I0是該技術的關鍵之一?；诹Ｗ咏贐oltzmann濃度分布、粒子粒徑不均勻性和隱失波光強公式，給出了粒子亮度概率密度分布的數值解。實驗測量粒子統(tǒng)計亮度分布后，依據實驗和理論分布相同原則可定量確定基準光強I0。采用φ100nm和φ250nm熒光粒子驗證此方法并定量分析了粒徑分散性對確定I0的影響。進一步采用φ100nm粒子進行近壁速度測量實驗，結果驗證了本方法的有效性。

全內反射測速技術（TIRV）；隱失波；基準光強；納米粒子；亮度分布

0 引 言

全內反射測速技術（TIRV）利用壁面隱失波將觀測區(qū)域限制在壁面附近幾百納米的薄層內，因此，相比傳統(tǒng)體照明顯微技術，該技術具有較高的信噪比和分辨率［1］。隱失波照明最早在生物醫(yī)學領域使用，近年來一些研究者嘗試將該技術用于受限布朗運動的測量和近壁區(qū)速度滑移的測量。Kihm、Banerjee等人采用全內反射熒光技術測量了近壁幾百納米區(qū)域內φ50-500nm粒子受限布朗運動［2-3］。Huang等采用TIRV測量了光滑玻璃表面的速度滑移［4］。Bouzigues等采用該技術研究了德拜長度內親疏水表面速度滑移并討論了靜電力和表面電勢的作用［5］。最近，Yoda和Kazoe采用隱失波照明技術測量了壓力驅動流和電滲流中近壁500nm以內區(qū)域的速度分布［6］。這些研究都表明TIRV技術在微納流動近壁測量中可以發(fā)揮重要的作用。可以說，基于全內反射隱失波的測速技術是目前最有效的百納米量級空間分辨率的流動顯示測量技術。更進一步，最新的一些結果顯示，隱失波技術用于考察界面附近的物理問題仍有廣闊的空間［7］。但是，該技術仍有些關鍵技術問題需要進一步解決。

在TIRV中，隱失波光強分布和其到壁面的距離成指數衰減的關系［8］，即

其中I0為界面處的隱失波基準光強，為穿透深度，n1為光密介質的折射率，n2為光疏介質的折射率，θ為入射角，λ為入射激光的波長。當熒光粒子處于隱失波照明場中時，其熒光光強的分布也符合這一規(guī)律。根據這一特性，測量粒子的亮度就可以獲得粒子垂向位置z。隱失波照明技術中，基準光強I0對定位的準確性有至關重要的影響，然而入射光經過介質到達界面時，其亮度是未知量。上述文獻中大多采用粘附在壁面上的粒子的亮度作為基準光強I0，但這種方法確定的基準光強存在很大的誤差。Bouzigues等［5］提到，實驗中測得粘附在壁面的粒子亮度有17%的標準偏差，這導致后續(xù)的粒子定位產生約17nm的誤差。Yoda等［6］指出，粒子的z向定位誤差最大來源是I0的不確定度，實驗中采用的示蹤粒子粒徑分散性大于6%，測量粘附壁面粒子的亮度作為I0，其偏差大于10%，這主要是由于熒光粒子粒徑的多分散性導致。Kazoe等［9］在研究近壁受限布朗運動時發(fā)現，實驗中粒子z向定位誤差在4.5～12nm，這主要來源于I0的確定有10%的誤差。Wang等［10］指出在隱失波照明場中，粒徑分散性將會給粒子垂向定位引入誤差。Choi等［11］采用了測量大量（100個以上）粘附在壁面上的粒子的平均亮度作為基準光強I0，但是粒子在水溶液中由于雙電層的排斥力，只有少量的粒子能夠吸附在壁面上。他們采用了100m Mol／L的NaCl溶液以減小粒子和壁面之間的雙電層厚度，使得大量的粒子能夠粘附在壁面上，進而測量其亮度值。這種方法因采用大量平均而減少了I0的誤差，但是此方法受限于高濃度鹽溶液，不容易推廣到一般水溶液的測量中。我們還發(fā)現由于長時間暴露在激光照明場內，光漂白使得粘附在壁面的粒子亮度迅速降低，更增加了確定I0的難度。這些因素都給基準光強I0的確定及后續(xù)的粒子垂向定位帶來了很大困難。

考慮到TIRV測量中，只有粒子亮度分布是最原始的測量數據，是否可以從亮度分布中找到可依據的信息來確定基準光強I0呢？Huang、Wang等人［4，10］曾根據近壁區(qū)的粒子濃度分布及粒子亮度指數衰減關系，并考慮了粒子的粒徑分散性，給出了粒子亮度的概率密度函數。然而其中的I0為未知參數，解析求解有很大難度。本文從統(tǒng)計大量粒子的亮度分布規(guī)律著手，同樣引入粒徑分散性、粒子的濃度分布來定量描述粒子亮度的統(tǒng)計規(guī)律，給出粒子無量綱亮度I／I0理論分布的數值解。同時實驗測量了隱失波光場內全部粒子亮度，得到了粒子亮度分布曲線，根據實驗和理論分布相同的原則，可以定量確定基準光強I0。這種方法不受實驗條件的限制，可以廣泛用于各種溶液和示蹤粒子。該方法定量的過程基于大量統(tǒng)計，可以進一步減小確定I0過程中的誤差；同時還能描述粒子濃度分布及粒子粒徑分散性對測量的影響。在此方法準確確定基準光強I0的基礎上，可以進一步測量距離壁面百納米附近流場的速度分布及納米粒子的動力學特性。

1 理論分析

依據近壁區(qū)示蹤粒子亮度的概率密度分布來確定界面處隱失波基準光強I0，首先要確定粒子亮度的概率密度分布。我們認為示蹤粒子在壁面附近的濃度分布符合Boltzmann分布［12］，即

其中C+表示粒子濃度的無量綱分布，Φ為粒子與壁面的靜電作用能，其表達式為：

其中ψ（z）為靜電勢，ψw為壁面的表面電勢，q為單電荷電量，qp為粒子的當量電量，kB為Boltzmann常數，T為溫度，κ為德拜長度的倒數，z為粒子中心到壁面的距離，a為粒子半徑的均值。式（3）為粒子在靜止流場液固界面附近的Boltzmann分布。根據我們前期的實驗［13］，在較小壁面剪切率下（如2000s-1以下），剪切流對近壁區(qū)粒子濃度分布影響可以忽略，Boltzmann分布仍然適用，在較大剪切率下，可以采用修正的Boltzmann分布。

如果納米粒子的粒徑分布符合高斯分布的特性，則其概率密度函數PDF（Probability Density Function）為，

其中，r為粒子半徑，σ為其標準偏差。由于熒光粒子的激發(fā)光強和粒子的體積（即粒徑的立方）成正比［2］，結合（1）式，粒子的亮度I（r，z）是其到壁面距離和粒徑的函數，可用下式表示，

將粒子的亮度采用I0歸一化處理，即

圖1 φ100nm納米粒子理論亮度分布Fig.1 Theoretical intensity distribution ofφ100nm nanotracers

圖2 實驗裝置簡要示意圖Fig.2 Schematic of the experimental setup

基于上述理論，利用Matlab數值解法，得到粒子亮度的概率密度函數的理論曲線。具體做法為，首先根據（2）、（3）式的Boltzmann分布生成總數N個粒子的垂向位置zi（i代表第i個粒子），根據（4）式正態(tài)分布生成N個粒子的半徑ri，然后根據（6）式計算這N個粒子的歸一化亮度Ii（ri，zi）／I0。至此，N個粒徑服從高斯分布，垂向位置服從Boltzmann濃度分布，并且亮度滿足垂向指數衰減規(guī)律的粒子生成完畢。最后，采取統(tǒng)計的方法計算所有生成的N個粒子的歸一化亮度I／I0的概率密度函數p（I／I0）。為了保證此計算統(tǒng)計量充足，粒子個數N達到5萬個以上。這里需要說明的是，式（2）、（3）和（4）中相關的參數，如粒子粒徑均值及標準偏差、靜電作用相關的粒子電量、壁面電勢和德拜長度，都可以通過獨立實驗測量確定。因此，對于不同工況的實驗，我們均可給出其歸一化亮度的概率密度函數p（I／I0）的曲線。

圖1為直徑為100nm熒光粒子歸一化亮度的理論概率密度函數p（I／I0）曲線，其中紅色實線是粒子粒徑相對標準偏差為17.5%時（此標準偏差值為實驗實測值）的理論預測亮度PDF，藍色虛線為粒徑均一時（相對標準偏差為0%）的理論預測亮度PDF。可以看出，粒徑分散性對粒子亮度分布PDF的影響主要體現在I／I0≈1附近的區(qū)域，也就是較亮粒子的分布區(qū)域。粒徑均一時，最大亮度Imax=I0；而粒徑標準偏差為17.5%時，最大粒徑的粒子亮度會達到約2I0。此方法可以有效定量描述粒徑分散性的影響。

2 實驗測量

實驗觀察采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，配有100倍／NA=1.45全內反射專用油鏡，如圖2所示。圖像采集使用Andor ixon897 EMCCD，全幅模式下為512pixel×512pixel，單像素寬為160nm，實驗中采用子區(qū)域拍攝，拍攝區(qū)域大小為80pixel× 150pixel。熒光粒子采用標稱直徑分別為100和250nm的聚苯乙烯小球，采用動態(tài)光散射測量其粒徑均值和標準偏差，分別約116.2±21nm和259.3 ±5.2nm，相對標準偏差分別為s=17.5%和s=2%。采用波長488nm的連續(xù)激光照明。

選取超純水配置溶液，熒光粒子的體積濃度約為0.002%。實驗在矩形截面管道中進行，管道的尺寸為19.1μm×56.0μm×30.0mm，實際測量區(qū)域為管道中間部分約12.8μm×24.0μm的區(qū)域。將配置好的溶液注入管道，待溶液穩(wěn)定后，用EMCDD記錄粒子的圖像，連續(xù)兩幀圖像的時間間隔Δt為7ms，其中曝光時間te為0.4ms，同一位置連續(xù)拍攝10000張。拍攝時，以粘附在壁面的粒子為參考，采用具有納米定位精度的壓電傳感器協(xié)助定位，把焦平面定位在壁面上。同一種實驗條件下，改變位置拍攝5組圖像。實驗時，溫度變化范圍在19～21℃，相對濕度為20%～40%。

根據實驗觀測，由于光漂白的作用，粘附在壁面的粒子在受較強隱失波照射約10s后，其亮度就會明顯衰減，粒子亮度衰減一半的時間約為30s。對于流體內部的粒子，只有它們進入隱失波照明區(qū)域才會受光漂白的影響。而運動的粒子在照明區(qū)域內一般連續(xù)出現1～3幀（2幀時間間隔為7ms）即7～21ms，遠小于光漂白作用約10s量級的衰減特征時間。因此，流體內的粒子受光漂白影響可以忽略。

采用Matlab軟件處理實驗圖像，獲取納米示蹤粒子的亮度信息，以測量其亮度分布，其中采用圖像的灰度值表征亮度。具體的圖像處理過程可分為圖像濾波、粒子識別、亮度確定3個步驟。為了保留粒子的原始亮度信息，在進行圖像濾波之前先復制原始圖像，在副本上進行圖像濾波、粒子識別處理，獲取粒子的坐標以后，返回原始圖像讀取粒子的最大亮度。圖像濾波是為了減小圖像中的單點噪聲，由于全內反射技術拍攝的圖像質量較好，粒子無光暈，采用灰度閾值即可濾除噪音點。粒子識別過程中先對圖像矩陣作出灰度值等值線，等值線圍起來的灰度峰值區(qū)域判斷為粒子區(qū)域，再根據質心法初步計算粒子位置。由于粒子光斑近似服從高斯分布，為了更精確地獲得亞像素精度的粒子位置，我們采用高斯擬合法對粒子初步位置附近5個像素范圍內進行二次定位，通過鄰域內的像素灰度值進行高斯擬合，獲得亞像素精度的粒子坐標。亮度確定是根據記錄到的粒子坐標，在其周圍5個像素的區(qū)域內查找最大灰度值像素點，作為粒子的亮度。圖3給出了連續(xù)3幀圖像中2個φ250nm粒子的運動過程，從圖中可以看出，粒子在運動的過程中其亮度有明暗變化，表征了粒子的垂向運動。

圖3 連續(xù)3幀圖像中2個φ250nm粒子的運動過程Fig.3 Movement of twoφ250nm particles in three consecutive images

3 實驗結果

拍攝的圖像經軟件處理后，得到粒子的亮度信息。由于亮度太低的粒子接近背景亮度Ib，粒子識別誤差較大，統(tǒng)計時首先選取約1.5Ib的亮度閾值濾除這部分粒子的干擾。對于φ100nm粒子，共統(tǒng)計約12600個粒子，粒子的概率密度分布如圖4所示。拍攝的粒子中亮度最大值Imax=1752，而拍攝時粘附在壁面上的粒子亮度由于光漂白作用僅為450。

圖4 φ100nm納米粒子測量亮度分布Fig.4 Measured intensity distribution ofφ100nm nanotracers

由于粒子理論亮度分布曲線（圖1）中各參數均由實驗測量確定，我們認為實測粒子亮度和理論亮度（圖4）具有相同的分布，由此可以計算出待測參數I0。具體做法如下：根據理論曲線（圖1）計算得到歸一化亮度范圍0.1≤I／I0≤1內粒子的概率為：

對于實驗數據（圖4），令：

采用數值積分，求得I0=880。顯然，采用此方法確定的基準亮度I0大于粘附在壁面上的粒子亮度（450）且小于最亮粒子亮度（1752）。此結果說明，目前不同方法之間確定I0有很大的不同，如果不采取有效的方法來確定I0可能引入很大的測量誤差。

圖5（a）給出了φ100nm粒子的測量亮度概率密度分布和理論概率密度分布的比較，縱坐標為概率密度（PDF），橫坐標為歸一化亮度I／I0。從圖5（a）中看出，在低亮度區(qū)域有一個位于I／I0=0.15的峰值。根據Boltzmann濃度分布，遠離壁面的粒子濃度較大，使得低亮度區(qū)的粒子較多。值得注意的是，有部分粒子的亮度超過基準光強I0，這體現了粒子粒徑分散性的影響。

采用同樣的辦法，計算并實測了φ250nm粒子亮度概率密度分布（圖5（b）），得到I0=1020。對比圖5（a）和（b）可以看出，由于φ250nm粒子的粒徑分散性（s=2%）遠小于φ100nm粒子的分散性（s= 17.5%），所以其亮度分布中，超過I0的粒子較少。同時，從測量的粒子亮度分布中可以看到，由于存在粒子粒徑分布不均勻性，拍攝到的粒子無量綱最大亮度Imax／I0可以達到約1.3（φ250nm粒子）和2.0（φ100nm粒子）。這也恰說明，簡單地從所有拍攝圖像中取粒子最大亮度來確定I0，會引入約30%甚至更高的定位誤差。

圖5 粒子測量亮度分布和理論分布比較Fig.5 Comparison between the measured and the theoretical intensity distributions of nanotracers

4 速度測量初步結果

我們還進行了矩形截面管道壁面附近速度測量，實驗條件和上述實驗相同，采用φ100nm聚苯乙烯小球作為示蹤粒子。在此基礎上，采用氣泵加壓驅動流動，壓力為2000Pa。首先，按照第2節(jié)中圖像處理方法對拍攝的圖像進行處理，得到所有粒子的水平位置（x，y）和亮度信息I；然后，采用上述方法確定I0，再根據式（1）計算粒子的垂向位置z。如前文所述，本文方法假設近壁粒子符合Boltzmann分布在靜態(tài)及低流速下適用。最后，根據粒子的水平位移計算粒子的速度。設在t時刻某一粒子的三維坐標為Mt（xt，yt，zt），在t+Δt時刻，該粒子的坐標為Mt+Δt（xt+Δt，yt+Δt，zt+Δt），流體流動方向為x方向，則粒子的速度V=（xt+Δt-xt）／Δt，垂向位置為zV=（zt+zt+Δt）／2。對所有拍攝到的粒子計算其在Δt內的速度V和垂向位置zV，根據粒子的垂向位置zV按照80nm的間距分層，統(tǒng)計每一層內的平均速度。

測量結果如圖6所示，圖中藍色實線為理論速度分布，空心圓圈是采用本文方法確定I0的速度測量結果，可見采用本文方法的測量速度基本與理論速度一致。圖中誤差條的長度根據同一層內所有統(tǒng)計的速度值的標準偏差給出，這是由納米粒子的布朗運動導致，通過大量統(tǒng)計平均消除。作為比較，我們還采用拍攝到的粒子最大亮度作為I0的方法，同樣給出了速度的分層測量結果，如圖6中實心圓圈所示。顯然，簡單由最亮粒子的亮度來確定I0，會導致粒子z定位30%以上的誤差，使得測量速度出現極大的誤差。這部分結果既是對本文方法可靠性的驗證，也說明了發(fā)展有效定量確定I0的方法在近壁NanoPIV測量中的必要性。

此外，從圖6中可以看出，在250nm以下的區(qū)域測量速度存在偏大的現象，這部分的誤差原因還在進一步研究中。

圖6 測量速度與理論速度的比較Fig.6 Comparison between the measured velocity data and the theoretical curve

5 結 論

全內反射顯微測量技術的關鍵在于確定隱失波界面基準光強I0，這是使用該技術對納米示蹤粒子進行準確垂向定位的基礎。本文針對此問題，給出了一套確定基準光強I0的方法，并用φ100nm和φ250nm熒光粒子進行亮度測試實驗。主要結果：

（1）首先根據粒子亮度隨高度呈指數衰減、粒子濃度Boltzmann分布以及亮度與粒徑三次方成正比的理論，給出粒子理論亮度概率分布的數值解。通過實驗測量納米示蹤粒子亮度分布。根據實驗與理論粒子亮度概率分布相同，確定基準光強I0。

（2）本實驗方法可定量給出不同粒徑粒子的I0值。實測φ100nm粒子的I0=880，φ250nm粒子的I0=1020。同樣條件下使用較大示蹤粒子得到的I0值也較大。

（3）實驗中發(fā)現粒徑分散性對Imax／I0有影響。φ250nm粒子粒徑相對標準偏差s=2%，其Imax／I0= 1.3，而φ100nm粒子粒徑s=17.5%，其Imax／I0= 2.0，因此僅取Imax作為I0將產生高達30%的誤差?？梢姴捎帽疚慕榻B的新方法來確定I0并進一步進行粒子z向定位是很有必要的。

（4）從速度測量結果來看，采用本文新方法確定I0得到的速度測量結果和理論曲線明顯符合更好。

致謝：感謝國家自然科學基金（No.11272322和No.11202219）的支持。

［1］Prieve D C，Frej N A.Total internal reflection microscopy：a quantitative tool for the measurement of colloidal forces［J］.Langmuir，1990，6（2）：396-403.

［2］Kihm K D，Banerjee A，Choi C K，et al.Near-wall hindered Brownian diffusion of nanoparticles examined by three-dimensional ratiometric total internal reflection fluorescence microscopy（3-D R-TIRFM）［J］.Experiments in Fluids，2004，37（6）：811-824.

［3］Banerjee A，Kihm K D.Experimental verification of near-wall hindered diffusion for the Brownian motion of nanoparticles using evanescent wave microscopy［J］.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys，2005，72（4 Pt 1）：42101.

［4］Huang P，Guasto J S，Breuer K S.Direct measurement of slip velocities using three-dimensional total internal reflection velocimetry［J］.Journal of Fluid Mechanics，2006，566：447-464.

［5］Bouzigues C I，Tabeling P，Bocquet L.Nanofluidics in the Debye layer at hydrophilic and hydrophobic surfaces［J］.Phys Rev Letters，2008，101（11）：114503.

［6］Yoda M，Kazoe Y.Dynamics of suspended colloidal particles near a wall：Implications for interfacial particle velocimetry［J］.Physics of Fluids，2011，23（11）：111301.

［7］Chan C U，Ohl C D.Total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the study of nanobubble dynamics［J］.Phys Rev Letters，2012，109：174501.

［8］Hecht E，Zajac A.Optics［M］.Reading Mass：Addison-Wesley，1974.

［9］Kazoe Y，Yoda M.Measurements of the near-wall hindered diffusion of colloidal particles in the presence of an electric field［J］.Applied Physics Letters，2011，99（12）：124104.

［10］Wang W，Guasto J S，Huang P.Measurement bias in evanescent wave nano-velocimetry due to tracer size variations［J］.Experiments in Fluids，2011，51（6）：1685-1694.

［11］Choi C K，Margraves C H，Kihm K D.Examination of nearwall hindered Brownian diffusion of nanoparticles：Experimental comparison to theories by Brenner（1961）and Goldman et al（1967）［J］.Physics of Fluids，2007，19（10）：103305.

［12］Zheng X，Kong G，Silber-Li Z.The influence of nano-particle tracers on the slip length measurements by microPTV［J］.Acta Mechanica Sinica，2013，29（3）：411-419.

［13］Zheng X，Silber-Li Z.The influence of Saffman lift force on nanoparticle concentration distribution near a wall［J］.Applied Physics Letters，2009，95（12）：124105-124105-3.

Determination of the interfacial evanescent wave base intensityI0in total internal reflection velocimetry（TIRV）

Shi Fei1，Zheng Xu2，Chen Rongqian1，Li Zhanhua2
（1.College of metrology and measurement engineering，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China；2.Institute of Mechanics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）

The total internal reflection velocimetry（TIRV）based on evanescent wave is an efficient method for velocity measurement within a few hundred nanometers to the wall.The evanescent wave intensity，I（z），decays exponentially with the distancezaway from the wall.When a nanotracer located in this field is illuminated by evanescent wave，its radiation intensity will also obey the exponential decay low，and thus it is possible to determine the nanotracer’szposition by its illuminated intensity.Obviously，one of the key issues of this technology is to determine the base intensityI0.In this paper，a numerical solution of the nanotracer intensity probability density function is given to predict the intensity distribution according to the exponential decay of the evanescent wave，the tracer concentration distribution and the tracer size variation.By comparing the measured intensity distribution with the theoretical prediction，the base intensityI0can be quantitatively determined.Fluorescent polystyrene spheres ofφ100nm andφ250nm are used in the measurements.The validity of this method is verified.The effect of the nanotracer size variation on the determination ofI0is also analyzed.Furthermore，φ100nm nanotracers are used to measure the velocity close to the wall，and the result verifies the validity of our method.

TIRV；evanescent wave；base intensity；nanotracer；intensitydistribution

O353.5

：A

1672-9897（2014）06-0080-06doi：10.11729／syltlx20140048

（編輯：李金勇）

2014-04-22；

：2014-07-22

國家自然科學基金（No.11272322和No.11202219）

李戰(zhàn)華，E-mail：lili＠imech.ac.cn

ShiF，ZhengX，ChenRQ，etal.Determinationoftheinterfacialevanescentwavebaseintensityl0intotalinternalreflectionvelocimetry（TlRV）.JournalofExperimentsinFluidMechanics，2014，28（6）：80-85.史 飛，鄭 旭，陳榮前，等.全內反射測速技術（TlRV）中界面隱失波基準光強l0的確定.實驗流體力學，2014，28（6）：80-85.

史 飛（1988-），男，安徽宿州人，碩士研究生。研究方向：微納尺度流動。通信地址：北京市北四環(huán)西路15號中國科學院力學研究所（100190）；E-mail：fly7277＠foxmail.com