EAE發(fā)病機(jī)制中MALT1、IL—17作用的探討

王貴泉+張宇+張美妮

【摘要】 目的：通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型，觀察小鼠腦組織中黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1與血清白介素-17（Interleukin-17）的表達(dá)情況，并探討兩者在EAE發(fā)病機(jī)制中的作用。進(jìn)一步探究MALTI是否可以作為多發(fā)性硬化（MS）的治療靶點(diǎn)，以便尋找治療MS的新手段。方法：將36只C57BL/6雌性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為EAE組和佐劑組各18只，EAE組采用MOG與完全弗氏佐劑的沫狀混合物制備EAE模型，佐劑組僅給予弗氏佐劑。觀察每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病情況并每隔2 d進(jìn)行一次神經(jīng)功能評(píng)分。分別于免疫后14 d、24 d、40 d兩組小鼠隨機(jī)各取6只，心臟取血并4%多聚甲醛灌注取腦組織。取小鼠腦組織石蠟切片，免疫組化方法檢測(cè)各組小鼠腦組織中MALT1并用ELISA法檢測(cè)血清IL-17表達(dá)。結(jié)果：EAE組與佐劑組的小鼠神經(jīng)功能評(píng)分、體重、血清中IL-17含量和腦組織中MALT1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EAE組中24 d組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分（2.50±0.55）分明顯高于14 d組的（0.83±0.41）分和40 d組的（1.50±0.32）分，體重（17.04±0.41）g明顯少于14 d組的（18.33±0.49）g和40 d組的（18.15±0.13）g，且血清中IL-17含量（288.00±26.45）pg/mL明顯高于14 d組的（122.60±10.11）pg/mL和40 d組的（184.40±29.51）pg/mL，腦組織中MALT1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（183.80±9.25）個(gè)明顯多于14 d組的（78.25±9.47）個(gè)和40 d組的（133.50±19.87）個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分越高，血清中IL-17含量越高，MALT1表達(dá)也越多，提示MALT1參與了EAE小鼠的發(fā)病過程，其機(jī)制可能與MALT1在EAE小鼠上調(diào)血清IL-17表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎； 多發(fā)性硬化； 黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1； 白介素17

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的炎性脫髓鞘疾病，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的脫髓鞘疾病即多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的動(dòng)物模型[1-2]。但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。在對(duì)EAE模型的研究中發(fā)現(xiàn)，自身反應(yīng)性腦炎性Th1和Th17 CD4+T細(xì)胞通過免疫活化并入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)單核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞聚集并引起與人類多發(fā)性硬化（MS）臨床癥狀、組織病理變化相類似的脫髓鞘等自身免疫性炎癥[3-4]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的致炎性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的致炎作用，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變[5]。有學(xué)者認(rèn)為，核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）活化后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)而引起脫髓鞘病變[6]。黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Mucosa associated lymphoid tissue lymphoma transport protein 1，MALT1）被認(rèn)為是NF-κB通路的激活物，利用敲除MALT1基因的小鼠誘導(dǎo)EAE，即使有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，也無EAE的任何癥狀[7-8]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于EAE的研究主要集于IL-17尚無MALT1在EAE發(fā)病機(jī)制中作用的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在探討MALT1及IL-17在EAE小鼠發(fā)病機(jī)制中作用的探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 將18～20 g，8～10周，C57BL/6雌性小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)技術(shù)有限公司）36只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為EAE組和佐劑組各18只。兩組小鼠一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）具有可比性。

1.2 EAE模型制備 用0.01 mol/L的PBS將MOG35-55（武漢博士德公司）稀釋。然后將稀釋液與等量含結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（武漢博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠背部中央偏頭側(cè)皮下點(diǎn)注射抗原乳劑。利用生理鹽水代替MOG35-55稀釋液參照上述方法制備乳劑，供對(duì)照組使用。各組于免疫后第0天、第2天分別進(jìn)行腹腔注射百日咳毒素（美國(guó)Sigma公司）600 ng/只作為免疫增強(qiáng)劑。

1.3 數(shù)據(jù)采集 小鼠經(jīng)MOG免疫后第8天開始，隔日采用盲法由兩名觀察者稱量并記錄每只小鼠的體重，采用國(guó)際通用的5分評(píng)分制對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無任何癥狀；1分，尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2分，一側(cè)后下肢無力，被動(dòng)翻身后可以恢復(fù)；3分，雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動(dòng)；4分，雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5計(jì)。

1.4 小鼠組織提取 分別于免疫后14、24、40 d，于EAE組與佐劑組中隨機(jī)抓取各6只小鼠（即14 d組、24 d組、40 d組），用10%水合氯醛0.1 mL/20 mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血并編號(hào)，左心室灌注磷酸鹽緩沖液至肝臟變白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大腦并編號(hào)。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清IL-17 小鼠血液離心后取血清零下70 ℃保存，IL-17的濃度采用上海西唐生物科技有限公司的ELISA試劑盒，具體方法參照試劑盒說明書。參照各因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，結(jié)果以pg/mL表示。

1.6 免疫組化 小鼠腦組織提取后于4%多聚甲醛中浸泡過夜，并脫水，石蠟包塊，MALT1抗體（1抗、2抗）購(gòu)自武漢博士德公司。參照試劑盒說明書操作，并在相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)老師指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組間參數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臨床癥狀評(píng)分與體重變化 EAE組小鼠8 d到10 d陸續(xù)開始發(fā)病，發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為皮毛不光滑、食欲下降、體重減輕、活動(dòng)量減少；同時(shí)相繼出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀，首先是表現(xiàn)為尾部肌張力低下，身體向一側(cè)傾倒，進(jìn)一步進(jìn)展為雙側(cè)后肢無力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，無因病情危重而死亡。佐劑組小鼠一直沒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，體重持續(xù)上升，與EAE小鼠相比，神經(jīng)功能評(píng)分差異顯著。如圖1所示，EAE組中14 d組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（0.83±0.41）分，24 d組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（2.50±0.55）分，40 d組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（1.50±0.32）分，其中兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EAE組與佐劑組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。如圖2所示，EAE組中14 d組小鼠體重為（18.33±0.49）g，24 d組小鼠體重為（17.04±0.41）g，40 d組小鼠體重為（18.15±0.13）g，其中14 d組與24 d組比較，24 d組與40 d組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），14 d組與40 d組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。佐劑組中兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），EAE組與佐劑組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 IL-17檢測(cè)結(jié)果 IL-17在血清中的ELISA檢測(cè)，用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-17 OD值，用軟件換算OD值與IL-17的濃度。EAE組中24 d組的小鼠血清中的IL-17濃度明顯高于14 d組和40 d組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。佐劑組中24 d組小鼠血清中的IL-17含量與14 d組和40 d組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而EAE組各小組與佐劑組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。結(jié)果表明，神經(jīng)功能評(píng)分較高時(shí)IL-17含量也較高。

2.3 MALT1免疫組化結(jié)果 采用免疫組化法（SV002兔-IgG-兩步法）檢測(cè)MALTI蛋白表達(dá)，其具體的步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。每組選取染色清晰石蠟切片，光鏡下（40×）隨機(jī)選取3個(gè)視野，并在高倍鏡下（400×）觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿可見免疫陽(yáng)性細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，EAE組中24 d組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于14 d組和40 d組，且EAE組中40 d組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于14 d組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而佐劑組中14 d組、24 d組和40 d組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而EAE組各小組與佐劑組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

MALT1作為NF-κB通路的一個(gè)激活成分，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NF-κB主要存在于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞，NF-κB是調(diào)控炎性反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，在EAE免疫調(diào)節(jié)及炎性反應(yīng)發(fā)展中有重要意義[7，9]。該信號(hào)系統(tǒng)能調(diào)控多種黏附分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及急性期蛋白的表達(dá)，并在炎性反應(yīng)和免疫誘導(dǎo)、細(xì)胞增殖和分化等EAE多種病理過程中發(fā)揮重要作用。此外NF-κB可促進(jìn)黏附分子表達(dá)，介導(dǎo)外周炎性細(xì)胞進(jìn)入腦組織[10]。MALT1基因剔除法表明，MALT1的支架功能在T細(xì)胞抗原受體（TCR）信號(hào)刺激的下游NF-κB活化中是必不可少的[11]。其蛋白酶活性對(duì)成熟的NF-κB反應(yīng)也是相當(dāng)重要的，該反應(yīng)決定了T細(xì)胞活化的程度[12]。

有研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞Th17被認(rèn)為是誘導(dǎo)EAE的主要反應(yīng)細(xì)胞，而Th17細(xì)胞產(chǎn)生致炎性細(xì)胞因子IL-17，其具有強(qiáng)烈的致炎作用，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MALT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多時(shí)，該小鼠血清中IL-17的含量也較高，同時(shí)其肢體功能障礙也較嚴(yán)重，這些結(jié)果提示MALT1可以促使IL-17的分泌。本結(jié)果可能與MALT1激活NF-κB通路，導(dǎo)致Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有些學(xué)者研究的MALT1影響Th17細(xì)胞的致炎性作用相似。

綜上所述，MALT1在EAE小鼠發(fā)病中有極其重要的作用，其機(jī)制可能是由于MALT1是NF-κB通路激活過程中一個(gè)重要的中心環(huán)節(jié)，并通過激活NF-κB而上調(diào)IL-17在血清中的含量，進(jìn)而引起自身免疫性脫髓鞘病變。進(jìn)一步研究如何抑制MALT1的表達(dá)或者抑制其激活NF-κB通路，可以為今后探索MS的治療靶點(diǎn)提供新思路。

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（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：歐麗）

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（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：歐麗）