超聲波輔助提取杜仲皮中的杜仲膠和杜仲黃酮

袁英髦, 曹雁平

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)為木蘭綱金縷梅亞綱杜仲目杜仲科落葉喬木,又名扯絲皮、絲棉皮、思仙、思仲、木綿、石思仙、絲連皮,為我國名貴藥用植物.隨著對杜仲在醫(yī)療、工業(yè)、保健等多個領(lǐng)域研究的不斷深入,尤其是具有膠塑二重性的杜仲膠,已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[1].除杜仲膠外,杜仲中還含有具有抗菌利膽、止血、增高白血球及抗病毒作用的綠原酸、黃酮類化合物等有效成分,黃酮類化合物中槲皮素具有抗自由基等作用[2].

目前對杜仲資源的利用,主要用于提取杜仲黃酮.因為杜仲膠經(jīng)濟(jì)價值不及杜仲黃酮,所以在提取黃酮過程后,杜仲膠就被舍棄.本實驗將杜仲皮首先分成兩部分,分別用于提取杜仲膠和杜仲黃酮,減少杜仲中有效成分的損失.

超聲波是頻率高于20 kHz的聲波[3],超聲輔助提取法是借助于超聲過程中產(chǎn)生的強烈空化作用來破壞植物細(xì)胞壁,加速細(xì)胞內(nèi)容物脫離植物基體進(jìn)入溶劑的過程[4].超聲產(chǎn)生的機械振蕩作用還可加快兩相間的傳質(zhì)過程,提高傳質(zhì)速率,增大提取效率[5].超聲輔助提取法的另一優(yōu)點是低溫提取,對于某些熱不穩(wěn)定的化合物尤為有效[6].Corrales等[7]比較了超聲輔助提取法、靜水壓法和脈沖電場法對從葡萄中提取花青素的能力.Sanz等[8]利用超聲場從大米中提取砷,提取率達(dá)到95%,提取時間只需幾分鐘,比傳統(tǒng)提取方法減少數(shù)小時.Matthieu等[9]利用超聲輔助提取法提取蘋果渣中的多酚物質(zhì),提取率提高20%.Venkatasubramanian等[10]利用超聲技術(shù)從甜菜中提取色素,提取率提高8%.Aparna等[11]研究了從杏仁中超聲輔助提取杏仁油的工藝,使提取時間縮短為6 h,提取率提高77%.曹雁平等[12-14]、易克傳等[15]對利用超聲輔助提取法從植物中提取茶多酚、咖啡因、大蒜素、絞股藍(lán)總皂甙等有效物質(zhì)進(jìn)行了深入研究,結(jié)果表明,超聲輔助提取技術(shù)可以加快提取速度,提高提取效率.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

杜仲皮,購于河北祁新中藥公司,產(chǎn)地四川.

FW-100型高速萬能粉碎機,中國中興偉業(yè)公司;ZW-0.05/7-x型無油空氣壓縮機,中國中浩公司;JXD-02型功率超聲器,中國金星公司;RVC 2-18型離心濃縮機,美國CHRIST公司;RF-5301pc型分光光度儀,日本島津公司;AVANCE III型核磁共振儀,瑞士布魯克公司.

石油醚(沸程60～90℃)、丙酮,分析純,購于北京化工廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲皮前處理

將5 g杜仲皮原料烘干后,用粉碎機粉碎.粉碎是為了破壞杜仲皮細(xì)胞壁和纖維質(zhì),使膠絲外露,有利于有機溶解提取.

1.2.2 物料分選

杜仲皮粉分成絮狀物和粉狀物兩部分,直徑1 mm以內(nèi)稱為粉狀物,大于1 mm為絮狀物,分別用于提取杜仲膠和杜仲黃酮.使用通過1 mm孔徑篩分(體積不同)和風(fēng)選篩分(比重不同)兩種方法進(jìn)行區(qū)分杜仲皮粉中的絮狀物和粉狀物.在空氣壓縮機出風(fēng)口接一長細(xì)管,出風(fēng)口直徑1.2 cm,面積1.13 cm2,,使其出風(fēng)均勻,物料在出風(fēng)口處下落直至靜止始終受到風(fēng)力影響,下落高度10 m.參數(shù)為物料質(zhì)量及空氣壓縮機出風(fēng)量,考察物料移動距離及分選質(zhì)量.將絮狀物和粉末分開,絮狀物用于提取杜仲膠,粉狀物用于提取杜仲黃酮.

1.2.3 超聲提取工藝流程

由于杜仲膠在高溫的石油醚中有很好的溶解性,將處理后的絮狀物原料與石油醚混合裝入圓底燒瓶置于85℃超聲水浴場中提取杜仲膠,以一定的超聲條件提取,圓底燒瓶上接冷凝回流裝置,避免有機提取溶劑損失.將粉狀物原料用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇在85℃下,提取杜仲黃酮.

1.2.4 杜仲膠的析出與精制

由于低溫環(huán)境下杜仲膠在石油醚中的溶解度急劇下降,將提取液過濾后,置于-20℃冰箱3 h冷凍析出杜仲膠,濾去溶劑得到粗膠,將粗膠用丙酮洗滌,離心濃縮后過濾得到純白色精膠.

1.2.5 提取條件的選擇

選取頻率為28,40,50,135 kHz的超聲波,在超聲功率0.05,0.15,0.25,0.35,0.45 W/cm2,提取時間1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h,物料質(zhì)量濃度50.00,62.50,83.33,125.00,250.00 mg/mL的范圍內(nèi)進(jìn)行研究.

1.2.6 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

105℃干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg,加甲醇溶解并定容至100 mL,配置成150 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 mL,加入體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇至5 mL,加0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2,5 min后加0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3,6 min后加2 mL1 mol/L的NaOH,用30%乙醇加至10 mL,510 nm測吸光度繪制曲線,用于杜仲黃酮定量.

2 結(jié)果與討論

2.1 物料分選

對5 g已用粉碎機打碎的杜仲原料進(jìn)行風(fēng)選,見表1.通過和1 mm孔徑篩分選的結(jié)果比較,由表1可知,風(fēng)速為4.9 m/s時,分選效果已經(jīng)基本達(dá)到目的,和1 mm篩選效果(3 g杜仲皮粉得到2 g絮狀物)近似.

表1 物料分選結(jié)果Tab.1 Results of material sorting

2.2 不同形態(tài)物料杜仲膠和杜仲黃酮含量的比較

將絮狀物和粉狀物的粒度以1 mm為界,直接提取黃酮,絮狀物中可提取ω(黃酮)=1%.先提取杜仲膠再提取黃酮,絮狀物可提取 ω(黃酮)=2.5%.直接提取黃酮,粉末中可提取ω(黃酮)=1.45%.先提取杜仲膠再提取黃酮,粉末可提取黃酮4%.直接提取杜仲膠,絮狀物中可提取ω(杜仲膠)=9%.先提取黃酮再提取杜仲膠,絮狀物可提取ω(杜仲膠)=1%.直接提取杜仲膠,粉狀物中可提取ω(杜仲膠)=2.5%.先提取黃酮再提取杜仲膠,粉末可提取ω(杜仲膠)=0.5%.

通過對絮狀物料和粉末狀物料分別在85℃下,物料質(zhì)量濃度50.00 mg/mL,用石油醚浸提2 h提取杜仲膠和85℃下,與物料質(zhì)量濃度50.00 mg/mL,用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液浸提2 h提取杜仲黃酮的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),將杜仲粉碎后,粉狀物中杜仲膠的含量遠(yuǎn)小于絮狀物中杜仲膠含量.并且,對物料先提取膠再提黃酮,更有利于杜仲膠和杜仲黃酮的利用.

2.3 超聲條件影響分析

2.3.1 超聲頻率對提取效果的影響

用石油醚85℃提取2 h,物料質(zhì)量濃度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮狀物,將超聲功率設(shè)定為0.25 W/cm2,研究超聲頻率分別為28,40,50,135 kHz下的提取效果,與非超聲提取效果進(jìn)行比較,結(jié)果如圖1.由圖1可知40 kHz的超聲頻率對杜仲膠的提取效果較好,相對于非超聲,提取量提高234%.

圖1 超聲頻率對杜仲膠提取效果的影響Fig.1 Effects of ultrasonic frequencies on yield of gutta-percha

2.3.2 超聲功率對提取效果的影響

用石油醚85℃提取2 h,物料質(zhì)量濃度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮狀物,將超聲頻率設(shè)定為40 kHz,研究功率分別為0.05,0.15,0.25,0.35,0.45 W/cm2下的提取效果,結(jié)果如圖2.圖2表明杜仲膠的提取量隨超聲功率的提高而增長.

圖2 超聲功率對杜仲膠提取效果的影響Fig.2 Effects of ultrasonic powers on yield of gutta-percha

2.3.3 時間對提取效果的影響

用石油醚在85℃下提取,物料質(zhì)量濃度50.00 mg/mL,3 g杜仲絮狀物,將超聲頻率設(shè)定為40 kHz,超聲功率設(shè)定為0.25 W/cm2,研究超聲時間分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h下的提取效果,結(jié)果如圖3.圖3表明杜仲膠的提取量隨提取時間的提高而增長.

圖3 時間對杜仲膠提取效果的影響Fig.3 Effects of different extraction time on yield of gutta-percha

2.3.4 物料質(zhì)量濃度對提取效果的影響

用石油醚在85℃下提取2 h,將超聲頻率設(shè)定為40 kHz,超聲功率設(shè)定為0.25 W/cm2,3 g杜仲絮狀物,研究物料質(zhì)量濃度分別為50.00,62.50,83.33,125.00,250.00 mg/mL條件下的提取效果,結(jié)果如圖4.圖4表明杜仲膠的提取量隨物料質(zhì)量濃度的提高而減小.

圖4 物料質(zhì)量濃度對杜仲膠提取效果的影響Fig.4 Effects of different mass concentration on yield of gutta-percha

2.4 杜仲膠的定性

2.4.1 韋氏法

用韋氏法[16]定性產(chǎn)物,將所得提取物0.1 g剪成細(xì)小顆粒,將其放入坩堝里,滴加少量的CCl4,待其發(fā)生溶脹后,加入4～6滴溴水,再在樣品表面加入2 g苯酚將其覆蓋.為加快其反應(yīng),將坩堝放置于沸水浴上,以蒸汽輔助加熱5 min,使CCl4揮發(fā).觀察產(chǎn)物顏色,若為紫色、褐色或藍(lán)色,則證明產(chǎn)物為杜仲膠.這種定性方法的優(yōu)點是靈敏度高.本實驗中所提取的產(chǎn)物呈褐色.

2.4.2 提取物的核磁譜圖

將微量提取物溶解于氘代苯,進(jìn)行1H-NMR分析,如圖5.將圖5進(jìn)行解析并與標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖[17]對比,確定結(jié)構(gòu)為杜仲膠.

圖5 杜仲膠核磁共振譜圖對比Fig.5 NMR spectra comparison of gutta-percha

3 結(jié) 論

研究表明,40 kHz的超聲波輔助提取效果較好,相對于非超聲,提取物質(zhì)量提高234%,3 g杜仲絮狀物,超聲功率0.45 W/cm2下物料質(zhì)量濃度50.0 mg/mL提取3 h,提取量可達(dá)0.49 g,并且提取量隨功率、提取時間和液料比的增加而提高.由于杜仲膠性質(zhì)穩(wěn)定,在鑒別方面一直存在困難,本實驗通過靈敏度高的韋氏法和精確度高的1H-NMR對產(chǎn)物進(jìn)行了鑒別,對本實驗結(jié)果的準(zhǔn)確度加以保證.

本研究為杜仲資源的綜合利用提供了新的思路,在提取黃酮的過程中,杜仲膠損失少,利用物料預(yù)處理分選的方式,使杜仲膠和杜仲黃酮達(dá)到分別提取的效果,并且在提取過程中加以超聲輔助,加快提取速度,提高提取效率.

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