Hsa-miR-204反義核酸提高M(jìn)OLT-4細(xì)胞對苦參堿的敏感性研究

孫文洪，何金花，韓澤平，黃國賢，朱麗梨，何琨儀，陳炳豪

（廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400）

Hsa-miR-204反義核酸提高M(jìn)OLT-4細(xì)胞對苦參堿的敏感性研究

孫文洪，何金花，韓澤平，黃國賢，朱麗梨，何琨儀，陳炳豪

（廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400）

目的 研究 miR-204的反義核酸（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204）聯(lián)合苦參堿觀察其對人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株（MOLT-4）生長與凋亡的影響及機(jī)制。方法 將一定濃度的人工合成的 AMO-miR-204經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染 MOLT-4細(xì)胞，并聯(lián)合不同濃度的苦參堿作用于MOLT-4細(xì)胞48 h后，采用MTT法檢測單用 AMO-miR-204、單用苦參堿及 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿對MOLT-4細(xì)胞增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞 Bcl-2mRNA的表達(dá)水平；克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成能力。結(jié)果 單用苦參堿的 IC50為0.75 mg·L-1；苦參堿與陰性對照聯(lián)合使用，IC50為 0.29 mg·L-1，表現(xiàn)為相加作用；苦參堿與 AMO-miR-204聯(lián)合使用，IC50為 0.07 mg·L-1，增敏倍數(shù)為 10.7，表現(xiàn)為協(xié)同作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：聯(lián)合組比單用組早期凋亡率明顯增高，凋亡率達(dá)25.4%。單用AMO-miR-204、苦參堿及兩者聯(lián)均能下調(diào) Bcl-2mRNA基因的表達(dá)水平，對 MOLT-4細(xì)胞克隆形成逐漸減小，其中兩者聯(lián)合的克隆數(shù)為（28±3.0）。結(jié)論

AMO-miR-204可提高M(jìn)OLT-4細(xì)胞對苦參堿的敏感性，其機(jī)制可能為通過下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)MOLT-4細(xì)胞早期凋亡，并抑制其克隆形成有關(guān)。

Hsa-miR-204；反義核苷酸；急性淋巴細(xì)胞白血病；苦參堿

有研究表明 microRNA-204（miR-204）在急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并扮演癌基因的角色［1］。在前期的研究中，設(shè)計(jì)針對成熟hsa-miR-204的反義寡核苷酸（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204），并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ALL細(xì)胞，結(jié)果表明 AMO-miR-204能有效抑制 MOLT-4的增殖能力，并促進(jìn)其凋亡?？鄥A是中藥苦參、山豆根和苦豆子的主要成分，經(jīng)臨床證實(shí)苦參堿可抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)［2］，并具有抗腫瘤生長的作用［3］。本研究旨在運(yùn)用AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿作用于人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株（MOLT-4），觀察其對 MOLT-4細(xì)胞的生長與凋亡的影響，為臨床上急性淋巴細(xì)胞白血病的中西醫(yī)結(jié)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（invitrogen公司）；Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；cellTiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑（Promega公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）；Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（keygen公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；苦參堿注射液（國藥準(zhǔn)字號：H10950071）購自西安東華生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 細(xì)胞株與反義寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)與合成人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株（MOLT-4），由廣州萊德爾生物技術(shù)有限公司提供。miR-204成熟序列為5’-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3’，設(shè)計(jì)AMO-miR-204序 列 為 5’-AGGCATAGGATGACAAAGGGAA-3’，均由廣州萊德爾生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d對細(xì)胞進(jìn)行傳代，使其匯合度為 30% ～50%，轉(zhuǎn)染采用 LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染micoRNA的mimics濃度為50 nm，轉(zhuǎn)染時(shí)使用 Opti-MEM培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期生長良好的MOLT-4細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，懸浮調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL。用OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋AMO-miR-204至0.6 μmol·L-1。將上述兩種稀釋液充分混勻，室溫孵育10 min。將 MOLT-4細(xì)胞重新混懸，按所需量加入轉(zhuǎn)染試劑中，輕柔震蕩使細(xì)胞分散均勻。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后吹打散均勻，以每孔 1×104個(gè)細(xì)胞接種96孔板，添加含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長基本匯合后，將培養(yǎng)液棄去，加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照 （control）組；（2）NC（negative control，陰性對照組，含隨機(jī)序列及脂質(zhì)體）；（3）AMO-miR-204組 （終濃度600 nmol·L-1）；（4）苦參堿組；（5）苦參堿組聯(lián)合AMO-miR-204組（苦參堿終濃度0.2、0.4、0.6、1.6、3.2 g·L-1）。置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)約 48 h，每孔加50 μL MTT溶液，置入孵箱孵育4 h。吸出上清液，每孔加150 μL DMSO，溶解顆粒，用平板搖床搖勻。用酶標(biāo)儀在490 nm處測每孔的光密度，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：增殖抑制率 ＝（對照組吸光度 -實(shí)驗(yàn)組吸光度）／對照組吸光度×100%。

1.5 Annexin V-FITC／PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

以1.0×106／孔的密度將人 MOLT-4細(xì)胞接種12孔培養(yǎng)板，每孔 1 mL。實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照 （control）組；（2）NC組（終濃度 600 nmol·L-1）；（3）AMO-miR-204組 （終濃度600 nmol·L-1）；（4）苦參堿組（終濃度1.6 g·L-1）；（5）苦參堿組聯(lián)合AMO-miR-204組（AMO-miR-204終濃度 600 nmol ·L-1）。培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，采用試劑盒提供的染色緩沖液重懸，加入FITC-AnnexinV試劑和 PI試劑，避光孵育 15 min，加入 200 μL染色緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞早期凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測 bcl-2 mRNA的相對表達(dá)水平 以 1.0×106／孔的密度將人 MOLT-4細(xì)胞接種于 12孔板，總體積 1 mL，細(xì)胞分組同上。12 h后加入 AMO-miR-204混合物，培養(yǎng) 48 h后，消化收集各組細(xì)胞，TRizol試劑提取RNA。采用 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。作為 PCR反應(yīng)的模版，bcl-2上游引物：5’-TCATGTGTGTGGAGAGCGTC-3’，下游引物：5’-AGCCTCCGTTATCCTGGATC-3’，擴(kuò)增片段大小117 bp。18S上游引物：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’，擴(kuò)增片段大小 112 bp。取模板 DNA采用 SYBRgreen摻入法進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng)，條件如下：95℃5 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 32 s共40個(gè)循環(huán)，所有的樣本檢測均包含一個(gè)不加模板的陰性對照，以排除假陽性的結(jié)果。運(yùn)用計(jì)算 2-△△Ct值來比較對照組和實(shí)驗(yàn)組的目的基因 mRNA相對表達(dá)量的差異。

1.7 克隆形成抑制試驗(yàn) 取對數(shù)生長期MOLT-4細(xì)胞，用含15%血清的培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為 3×102個(gè)／mL，接種于12孔板，每孔1 000 μL，每組2復(fù)孔。細(xì)胞分組同上。轉(zhuǎn)染后置37℃，5%CO2，飽和濕度條件培養(yǎng)箱內(nèi)孵育7 d，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定液固定 10 min，吉姆薩染色30 min后流水沖洗，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克?。ǎ?0個(gè)細(xì)胞記一個(gè)克?。┎⑴恼?，克隆形成抑制率＝（對照組細(xì)胞克隆數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)）／對照組細(xì)胞克隆數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（one-way ANOVA）分析，各組間兩兩比較為 LSD檢驗(yàn)。P值小于0.05示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

運(yùn)用金正均 Q值法計(jì)算AMO-miR-204與苦參堿聯(lián)合使用的效果Q＝Ea+b／（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea和Eb分別為單用 AMO-miR-204和單用苦參堿的抑制率，Ea+b為兩者聯(lián)合用藥的抑制率。式中分子代表“實(shí)測合并效應(yīng)”，分母是“期望合并效應(yīng)”，Q值是兩者之比，Q＜0.85為拮抗，0.85≤Q＜1.15為相加，Q≥1.15為協(xié)同作用。藥物增敏倍數(shù) ＝單純用藥組的 IC50／合用藥組的 IC50。

2 結(jié)果

2.1 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿對 MOLT-4細(xì)胞增殖的影響 單用苦參堿的IC50為 0.75 mg·L-1；苦參堿與陰性對照聯(lián)合使用，IC50為 0.29 mg·L-1，表現(xiàn)為相加作用（0.85≤Q＜1.15）；苦參堿與 AMO-miR-204聯(lián)合使用，IC50為0.07 mg·L-1，增敏倍數(shù)為10.7，表現(xiàn)為協(xié)同作用（Q≥1.15）。見表1。

表1 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿對MOLT-4細(xì)胞增殖抑制率

圖1 Annexin V-FITC／PI雙染色法檢測細(xì)胞早期凋亡率

2.2 Annexin V-FITC／PI雙染色法檢測細(xì)胞早期凋亡率 單用AMO-miR-204、苦參堿作用于MOLT-4細(xì)胞48 h后，均能誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，與NC組（陰性對照組）以及空白對照 （control）組相比，沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但兩者聯(lián)合組比單用組早期凋亡率明顯增高，凋亡率達(dá)25.4%，與 NC組（陰性對照組）以及空白對照（control）組相比，未有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖1）。

2.3 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿bcl-2 mRNA的相對表達(dá)水平的影響 單用 AMO-miR-204、苦參堿及兩者聯(lián)合作用于 MOLT-4細(xì)胞 48 h后，均能下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)水平。其中聯(lián)合組較明顯，說明兩者通過下調(diào) Bcl-2基因的表達(dá)水平從而抑制 MOLT-4細(xì)胞的增殖（圖 2）。

圖2 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿bcl-2 mRNA的相對表達(dá)水平的影響

2.4 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿對 MOLT-4細(xì)胞克隆形成的影響 與空白對照組比較，陰性對照組未見明顯差異。而 AMO-miR-204、苦參堿組對MOL-4細(xì)胞克隆形成逐漸減小，與空白對照組、陰性對照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng) MO-miR-204聯(lián)合苦參堿時(shí)，對 MOL-4細(xì)胞克隆形成的數(shù)明顯減少，與空白對照組、陰性對照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿通過抑制對MOLT-4細(xì)胞克隆的形成抑制細(xì)胞增殖（圖3）。

圖3 AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿對MOLT-4細(xì)胞克隆形成的影響

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤，近幾年兒童ALL的長期無病存活率明顯提高，部分發(fā)達(dá)國家已達(dá)80%，但仍有約20%的患兒復(fù)發(fā)死亡［4］。如何防止復(fù)發(fā)，避免不必要的過度化療一直是兒科血液腫瘤研究者期待解決的問題［5］。Hsa-miR-204在ALL中表現(xiàn)為上調(diào)，Hsa-miR-204在ALL中扮演癌基因的角色。Hsa-miR-204首次被發(fā)現(xiàn)與惡性血液病相關(guān)。當(dāng)miRNA在腫瘤中高表達(dá)時(shí)，導(dǎo)入與其互補(bǔ)的反義寡核苷酸序列，使其表達(dá)降低，從而可以調(diào)節(jié)腫瘤基因表達(dá)水平的角度來實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的，該方法被認(rèn)為可能是目前抑制miRNA活性最好而且最實(shí)際的方法［6-7］。傳統(tǒng)中藥苦參堿是從苦參根及苦豆子中提取的一種生物堿，關(guān)于苦參堿誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究主要集中于髓系白血病領(lǐng)域。苦參堿可抑制髓系白血病 K562細(xì)胞和 L1210細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，苦參堿誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡這一藥學(xué)特性倍受研究者們的關(guān)注［8］。因此，本研究以 Hsa-miR-204為切入點(diǎn)設(shè)計(jì)了這一實(shí)驗(yàn)，利用Hsa-miR-204的反義核酸AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿共同作用于急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株MOLT-4，觀察其對MOLT-4細(xì)胞的增抑制殖作用，為臨床上急性淋巴細(xì)胞白血病的中西結(jié)合治療提供理論依據(jù)。

在本研中單用苦參堿的 IC50為0.75 mg·L-1；苦參堿與陰性對照聯(lián)合使用，IC50為 0.29 mg·L-1，表現(xiàn)為相加作用（0.85≤Q＜1.15）；苦參堿與AMO-miR-204聯(lián)合使用，IC50為 0.07 mg·L-1，增敏倍數(shù)為10.7，表現(xiàn)為協(xié)同作用（Q≥1.15）。進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR檢測AMO-miR-204聯(lián)合苦參堿Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示：AMO-miR-204、苦參堿及兩者聯(lián)合作用于MOLT-4細(xì)胞48 h后，均能下調(diào) Bcl-2基因的表達(dá)水平。其中聯(lián)合組較明顯，說明兩者通過下調(diào) Bcl-2基因的表達(dá)水平從而抑制 MOLT-4細(xì)胞的增殖。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明兩者聯(lián)合具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡的作用。

綜上所述，AMO-miR-204可提高 MOLT-4細(xì)胞對苦參堿的敏感性，其機(jī)制可能為通過下調(diào) Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn) MOLT-4細(xì)胞早期凋亡，并抑制其克隆形成有關(guān)。總之，本研究數(shù)據(jù)為急性淋巴細(xì)胞白血病的中西醫(yī)治療提供了參考依據(jù)，其臨床實(shí)際應(yīng)用前景與潛力值得進(jìn)一步深入研究。

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AMO-miR-204 antisense oligonucleotides enhance the sensitivity of MOLT-4 cells to matrine

SUN Wen-hong，HE Jin-hua，HAN Ze-ping，et al
（Department of Laboratory Tests，Panyu Center Hospital，Guangzhou 511400，China）

Objective To study the effect of antisense oligonucleotides targeted on has-miR-204（anti-miR204 oligonucleotides，AMO-miR-204）for enhancing the matrine sensitivity of acute lymphoblastic leukemia cells and its possible acting mechanism.Methods Dosing and chemosynthetic antisense oligonucleotides targeted on has-miR-204 was transfected to the cells using Lipofectamine TM 2000 and combined with different concentrations of matrine.The inhibitory effects of matrine and AMO-miR-204，used singly or in combination，on cell proliferation were detected by MTT and clone formation assay.The expression of Bcl-2 mRNA was analyzed by real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction.The percentage of apoptosis cells was determined by flow cytometry.Results Used in combination with AMO-miR-204，the IC50of matrine could be lowered from 0.75 mg·L-1to 0.07 mg·L-1，and the sensitivity of cells to procyanidin increased to 10.7.The amount of apoptotic cells increased significantly.The early apoptotic rate was 25.4%.Transfection with AMO-miR-204 alone or combind with matrine could down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA in cells.The colon formation ability was decreased.Conclusions Combined use of AMO-miR-204 could increase the sensitivity of MOLT-4 cells to matrine.The mechanism may be to promote MOLT-4 cells early apoptosis and down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA，which provides a novel potential approach for treatment of acute lymphoblastic leukemia.

Hsa-miR-204；antisense oligonucleotides；acute lymphoblastic leukemia；matrine

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.009

2013-11-12，

2013-12-06）

廣東省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（No 20121018）