無患子皂素水提液發(fā)酵精制聯(lián)產(chǎn)表面活性劑鼠李糖脂

付堯，趙丹青，孫達(dá)峰，張衛(wèi)明，朱莉偉，蔣建新

（1北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042）

無患子皂素水提液發(fā)酵精制聯(lián)產(chǎn)表面活性劑鼠李糖脂

付堯1，趙丹青1，孫達(dá)峰2，張衛(wèi)明2，朱莉偉1，蔣建新1

（1北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042）

以無患子皂素水提水解液為底物，發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑，在精制無患子皂素的同時(shí)發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂。經(jīng)銅綠假單胞菌發(fā)酵后發(fā)酵完成液中不含葡萄糖，葡萄糖的消耗速率與接種量成正相關(guān)，在發(fā)酵液中額外添加大豆油可促進(jìn)表面活性劑親油基團(tuán)的生成，溶液表面活性進(jìn)一步提高。發(fā)酵后溶液中表面活性物質(zhì)濃度達(dá)到50.8g/L，比對(duì)照組提高了16.1%，溶液表面張力明顯降低。接種10%的菌種發(fā)酵獲得的無患子皂素復(fù)合產(chǎn)物干粉其臨界膠束濃度由10g/L降低到2.5g/L，臨界膠束濃度下的復(fù)合產(chǎn)物水溶液表面張力比未接種菌種的低18.67%，復(fù)合產(chǎn)物具有很好的起泡性能及更高的泡沫穩(wěn)定性。

無患子水提皂素液；鼠李糖脂；發(fā)酵精制；表面活性；泡沫性能

天然皂素又稱皂苷，是可形成水溶液或膠體溶液并能產(chǎn)生肥皂狀泡沫的植物糖苷統(tǒng)稱，主要由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有機(jī)酸組成，能有效降低水的表面張力，是一種天然、無毒、無污染的表面活性劑。無患子（Sapindus mukurossiGaertn.），又名油患子、木患子、苦患樹等，屬無患子科，為落葉大喬木，樹高可達(dá)20余米，樹皮灰褐色或黑褐色，主要分布于我國東部、南部至西南部。根和果入藥，具有清熱解毒、化痰止咳的功能，目前福建省已種植無患子50多萬畝[1-2]。無患子果殼中含有約15%～25%無患子皂素，無患子皂素具有良好的起泡性能，其表面活性物質(zhì)為三萜皂苷類和倍半萜糖苷類、脂肪油和蛋白質(zhì)，是一種天然優(yōu)質(zhì)的非離子表面活性劑。無患子皂素能有效去除污垢，具有良好的清潔能力，并且在一些文獻(xiàn)中報(bào)道具有抗菌、增白、祛斑、祛痘、防止皮膚病的藥用功能[3-5]，可以在各種護(hù)膚品中作為天然活性物質(zhì)的主要成分。

生物表面活性劑是特定微生物在特定條件下分泌的具有表面活性性能的一類代謝產(chǎn)物[6-8]。生物表面活性劑具有降低表面張力、提高泡沫性能、穩(wěn)定乳化液等，與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑還具有選擇性和專一性、無毒、生物相容性好、能生物降解等優(yōu)點(diǎn)[9]，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及阻燃材料[10]等領(lǐng)域。

無患子水提皂素液中含有豐富的皂素和大量的糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)的存在導(dǎo)致無患子皂素液體產(chǎn)品性能極不穩(wěn)定，需要進(jìn)一步分離精制。銅綠假單胞菌是能夠生產(chǎn)生物表面活性劑的菌種，可以利用葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)鼠李糖脂，具有較高的產(chǎn)量[11]。本研究根據(jù)無患子水提皂素液中含有較高濃度的纖維二糖和葡萄糖，纖維二糖經(jīng)酶水解，以水解液為底物，接種銅綠假單胞菌和相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。銅綠假單胞菌利用無患子水提液中的葡萄糖碳源轉(zhuǎn)化為鼠李糖脂——一種高效的生物表面活性劑，皂素精制發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)生物表面活性劑，生產(chǎn)過程簡(jiǎn)潔高效。將無患子水提液中的糖、蛋白等干擾雜質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)品中的有效組分，獲得的無患子精制液體產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，純度高，有望應(yīng)用于制備液體洗滌劑或其他液體產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

原料與試劑： 無患子果皮，福建三青公司提供；纖維二糖酶，Novozymes公司提供；化學(xué)試劑均為分析純；瓊脂、酵母膏、蛋白胨和牛肉膏由北京奧博星公司提供；銅綠假單胞菌（CGMCC1.50）來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

實(shí)驗(yàn)儀器：L-550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，手提式不銹鋼高壓蒸汽消毒器，HIQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱， Eppendoff 移液槍100μL/1000μL，MJ-16B-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，JK99B全自動(dòng)表面張力儀，PHS-25數(shù)顯pH計(jì)，UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì)，Leica CM E 生物顯微鏡，Waters 2695e高效液相色譜儀，B-260旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，2151羅氏泡沫儀，DZF-6051 型真空干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置

固體培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5.0，蛋白胨10，瓊脂15，牛肉膏3.0。液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏，NaCl 5.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.25，NaNO33.0， KH2PO40.25，酵母膏1.0。

1.2.2 產(chǎn)表面活性劑菌株的種子培養(yǎng)

吸取銅綠假單胞菌菌懸液加入到對(duì)應(yīng)的固態(tài)斜面培養(yǎng)基中，菌種在30℃下培養(yǎng)1天，生長出得到菌株的為一代菌株。挑取一代菌落劃線接種到固態(tài)斜面培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)1天生長出獲得的菌株為二代菌株。將二代菌株重復(fù)上述步驟，培養(yǎng)得到的第三代后菌種形態(tài)與性質(zhì)基本穩(wěn)定。將第三代菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在搖床中震蕩培養(yǎng)12h，制備成種子懸液，培養(yǎng)條件為液體培養(yǎng)基中加入適量玻璃珠，130r/min，30℃培養(yǎng)12h。

1.2.3 無患子水提皂素液制備

將無患子干燥果皮粉碎，過20目篩，稱取50g，加入300 mL去離子水，在60℃搖床中以150r/min速度提取4h。提取離心分離（3000r/min，15min），上層清液為無患子水提皂素液。液相色譜分析上層清液纖維二糖、葡萄糖濃度。調(diào)節(jié)溶液pH值至4.8，加入10 IU纖維二糖酶，45℃，180r/min的恒溫培養(yǎng)箱中酶解96h，酶解前12h每2h取一次樣；12h后每12h取一次樣。將酶解后的水提液調(diào)節(jié)pH值至7.0，作為銅綠假單胞菌的發(fā)酵底物。

1.2.4 銅綠假單胞菌發(fā)酵

將牛皮紙，三角瓶加棉塞、發(fā)酵培養(yǎng)基、去離子水等滅菌（121℃，20 min）。三角瓶中加入30mL無患子水提皂素酶解液，共5組。1號(hào)為空白組，無培養(yǎng)基，不接菌種，加入無菌水至體積其他實(shí)驗(yàn)組相同。2、3、4號(hào)實(shí)驗(yàn)組分別加入相同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，并接入銅綠假單胞菌，接種量分別為2%、5%和8%。5號(hào)為3號(hào)的對(duì)照組，額外加入5g/L大豆油。30℃，130r/min的發(fā)酵168h。濃硫酸-香草醛法[12]檢測(cè)發(fā)酵液中表面活性物質(zhì)濃度，液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中糖濃度，全自動(dòng)表面張力儀測(cè)定發(fā)酵液表面張力。

1.2.5 表面活性劑干粉制備

100g無患子干燥果皮，加入300mL去離子水按1.2.4節(jié)相關(guān)步驟水提酶解后制得酶解液，分成3份，設(shè)置空白組（T-0，未接種菌種，用無菌水補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基）和平行對(duì)照組（T-1和T-2，接種10%的銅綠假單胞菌，相同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基）進(jìn)行發(fā)酵168h。發(fā)酵液置于離心機(jī)中以4000r/min離心15min，收集的上層清液用濾紙過濾除去不溶性雜質(zhì)，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，再放入60℃的真空干燥箱中干燥制成復(fù)合產(chǎn)物干粉。

1.2.6 復(fù)合產(chǎn)物表征

臨界膠束濃度（cmc）測(cè)定： 配制T-0、T-1、T-2干粉的一系列不同濃度的皂素溶液，采用吊片法于30℃測(cè)定其表面張力，繪制以溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)的曲線，從曲線上的突變點(diǎn)讀取臨界膠束濃度cmc。

泡沫性能的測(cè)定：采用Rose-Miles實(shí)驗(yàn)方法[13]，測(cè)定T-0、T-1、T-2在cmc值下0、30s、5min、10min、15min、30min時(shí)的泡沫高度，羅氏泡沫儀的操作溫度為（40±1）℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌種子培養(yǎng)

銅綠假單胞菌在經(jīng)過三代的培養(yǎng)，菌株形態(tài)及活性已基本穩(wěn)定，可作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。菌株培養(yǎng)12h后有少量菌落生成，培養(yǎng)基形成一層白膜，培養(yǎng)24h后完全長出菌落。菌體生長過程中產(chǎn)生水溶性色素，如帶熒光的水溶性熒光素、綠膿素等，培養(yǎng)1天后的培養(yǎng)基呈淺綠色。顯微形態(tài)觀察觀察表明菌體細(xì)胞呈桿狀，成短鏈狀排列。

2.2 水提皂素液酶解

水提液酶解過程中的葡萄糖濃度隨著時(shí)間的延長而升高，而纖維二糖濃度隨著時(shí)間的延長而降低，如圖1所示。水提皂素液中纖維二糖的初始濃度為33.75g/L，完全酶解后，香草醛-濃硫酸法測(cè)得的皂素濃度為133.6g/L，葡萄糖濃度為27.93g/L。水解前10h，葡萄糖的轉(zhuǎn)化速率快；纖維二糖在水解前10h酶解最為明顯，在以后的酶解過程中葡萄糖的生成率趨于平緩。在水解72h 時(shí)，纖維二糖完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖濃度達(dá)到最高，完成酶解過程。

圖1 無患子水提皂素液酶解中纖維二糖和葡萄糖濃度變化

圖2 無患子水提皂素液表面張力隨水解時(shí)間的變化情況

酶解過程中溶液表面張力隨時(shí)間的變化情況如圖2所示，溶液表面張力在57.2mN/m上下波動(dòng)。水解前10h溶液表面張力波動(dòng)幅度較大。酶將纖維二糖降解為葡萄糖，溶液中葡萄糖濃度突然增大，而無患子皂素結(jié)構(gòu)中也有糖基，可能導(dǎo)致表面張力有一定的變化。由圖1得知，在水解10h后溶液中葡萄糖轉(zhuǎn)化率較低，糖濃度對(duì)溶液中皂素表面張力影響也較小，所以在水解后期，溶液表面張力比較平緩。總體而言，溶液表面張力隨酶解過程變化幅度不大，說明皂素結(jié)構(gòu)及性質(zhì)在酶解過程中保持穩(wěn)定。

2.3 無患子水提液發(fā)酵精制聯(lián)產(chǎn)鼠李糖脂生物表面活性劑

銅綠假單胞菌是在一定條件下的共同細(xì)菌在自然界中可分泌鼠李糖脂的生產(chǎn)。水提取無患子皂素溶液為底物，發(fā)酵鼠李糖脂得到復(fù)合產(chǎn)品無患子皂素及生物表面活性劑，其糖濃度的變化如圖3所示。空白對(duì)照組發(fā)酵液中葡萄糖濃度從25.33g/L下降為13.63g/L，這可能因?yàn)樯倭侩s菌轉(zhuǎn)化了部分葡萄糖，空白組最終pH值為7.04。菌株的接種量對(duì)發(fā)酵過程的影響如圖3所示，8%接種量其葡萄糖轉(zhuǎn)化速率最快，接種量越大，葡萄糖轉(zhuǎn)化速率越高，2%、5%和8%接種量最終發(fā)酵液pH值分別為7.60、6.78和6.96。在發(fā)酵初期菌種轉(zhuǎn)化葡萄糖的能力不高，為調(diào)整適應(yīng)期，接入菌種的樣品組和空白組的葡萄糖轉(zhuǎn)化速率基本相同。發(fā)酵144h時(shí)，發(fā)酵液中葡萄糖濃度接近0。葡萄糖和脂肪都可以用作銅綠假單胞菌的發(fā)酵碳源，加入5g/L大豆油的復(fù)合碳源對(duì)照組可以看出，銅綠假單胞菌利用葡萄糖的速率減小。與3號(hào)實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，大豆油可使發(fā)酵體系碳源濃度增大，發(fā)酵初期葡萄糖轉(zhuǎn)化速率減小，發(fā)酵為168h時(shí)發(fā)酵液中的葡萄糖完全轉(zhuǎn)化，發(fā)酵完成液pH值6.7。

圖3 葡萄糖濃度隨著銅綠假單胞菌發(fā)酵時(shí)間的變化

發(fā)酵過程中溶液表面張力隨時(shí)間的變化如圖4所示，空白對(duì)照組及接種量分別為2%、5%、8%的實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵前100h 的表面張力基本在57mN/m上下浮動(dòng)。在接種量為5% 的實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵液在120h時(shí)表面張力下降明顯，形成的生物表面活性降低了溶液的表面張力，在168h時(shí)接種量分別為2%、5%和8%實(shí)驗(yàn)組的最終表面張力分別為56.69mN/m、55.12mN/m和56.14mN/m，均低于空白對(duì)照組的最終表面張力57.47mN/m。加入大豆油的實(shí)驗(yàn)組中發(fā)酵24h 時(shí)溶液表面張力迅速降低，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的增長溶液表面張力降低至54mN/m，最終溶液表面張力小于空白對(duì)照組和無大豆油底物的實(shí)驗(yàn)組，說明加大豆油實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了更多的表面活性類物質(zhì)鼠李糖脂，油脂作為碳源可促進(jìn)表面活性劑親油基團(tuán)的生成。加入大豆油的實(shí)驗(yàn)組中發(fā)酵144h溶液表面張力有所上升，可能與銅綠假單胞菌發(fā)酵后期產(chǎn)生一些副產(chǎn)物有關(guān)。此外，與接種量為8%的實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，大豆油可以降低銅綠假單胞菌接種量，并且能夠較大幅度降低溶液表面張力。

圖4 銅綠假單胞菌接種量對(duì)發(fā)酵過程中溶液表面張力的影響

2.4 復(fù)合產(chǎn)物表征

發(fā)酵完成時(shí)溶液表面活性劑如表1所示，銅綠假單胞菌發(fā)酵后溶液中表面活性劑濃度均有升高，空白組溶液中是無患子皂素。發(fā)酵液最終表面活性劑濃度隨著接種量的提高而提高，在加入大豆油作為額外碳源時(shí)，發(fā)酵得到的表面活性劑濃度最高。溶液表面張力降低，表面活性劑濃度升高，說明無患子皂素與生物表面活性劑鼠李糖脂不但具有很好的相容性，同時(shí)具有協(xié)同增效作用[14]。

在30℃下，無患子皂素及精制發(fā)酵皂素的水溶液表面張力隨溶液濃度變化規(guī)律如圖5所示，T-0的臨界膠束濃度（cmc）值很高，遠(yuǎn)高于T-1和T-2；T-0的最低表面張力也遠(yuǎn)高于T-1和T-2。T-1的cmc值為2.5g/L，最低表面張力為41.95mN/m；T-2的cmc值為2.5g/L ，最低表面張力為40.94mN/m。T-1與T-2這兩者的性能相差不大，符合平行樣的要求。當(dāng)溶液濃度為2.5g/L時(shí)，T-2的最終表面張力為42.00mN/m，T-0的最終表面張力為51.64mN/m，說明菌株經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂使溶液表面張力值同比下降了18.67%，表面活性得以提高。

表1 發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液表面活性劑濃度

圖5 3種復(fù)合產(chǎn)物表面活性劑表面張力與濃度對(duì)數(shù)關(guān)系（30℃）

在40℃下，無患子水提皂素干粉及精制發(fā)酵干粉的泡沫性能如表2所示，可以看出3種表面活性劑在臨界膠束濃度下，泡沫高度隨著時(shí)間的延長而降低。T-0的起泡性能雖然比T-1（T-2）高出6.5%，但是T-1（T-2）泡沫穩(wěn)定性比T-0高出31.2%。說明接入菌種進(jìn)行發(fā)酵后產(chǎn)生的鼠李糖脂與無患子皂素復(fù)合產(chǎn)物具有很好的起泡性能，并且具有更高的泡沫穩(wěn)定性能。

表2 表面活性劑在臨界膠束濃度下的泡沫性能（40℃）

3 結(jié) 論

（1）將無患子水提皂素液中較高濃度的纖維二糖酶解轉(zhuǎn)化為葡萄糖，銅綠假單胞菌以水解液作為發(fā)酵底物，經(jīng)發(fā)酵后水提液中的葡萄糖完全被消耗，葡萄糖的消耗速率與接種量與成正相關(guān)。添加額外大豆油后，在一定程度上降低菌種的用量，且可以顯著降低發(fā)酵液表面張力，加入一定量油脂會(huì)促進(jìn)表面活性劑親油基團(tuán)的生成。

（2）銅綠假單胞菌發(fā)酵后溶液表面張力降低，溶液中表面活性劑濃度升高。接種10%的菌種發(fā)酵獲得的復(fù)合產(chǎn)物干粉的臨界膠束濃度由10g/L降低到2.5g/L，臨界膠束濃度下的水溶液表面張力比未接種菌種低18.67%，復(fù)合產(chǎn)物具有很好的起泡性能及更高的泡沫穩(wěn)定性。（3）利用無患子水提皂素液中的葡萄糖作為 碳源，在精制皂素的同時(shí)發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂，將無患子水提液中的糖、蛋白等干擾雜質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)品中的有效組分，制得的無患子精制液體產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、純度高，可直接應(yīng)用于制備液體洗滌劑或其他液體產(chǎn)品。

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Cogeneration biosurfactant rhamnolipid with Sapindus mukurossi saponin water extraction by refining process of fermentation

FU Yao1，ZHAO Danqing1，SUN Dafeng2，ZHANG Weiming2，ZHU Liwei1，JIANG Jianxin1
（1School of Material Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042，Jiangsu，China）

Sapindussaponin water extraction，hydrolyzed byCellobiaseand inoculated withPseudomonas aeruginosa，was fermented to produce biosurfactant rhamnolipid. After fermentation，glucose was completely consumed，and glucose consumption rate was positively rated with loading ofPseudomonas aeruginosa. In the fermentation broth，additional soybean oil could promote formation of surfactant lipophilic group，and solution surface activity was further improved. After fermentation，the concentration of surface active material reached 50.8g/L，16.1% higher than that of the control experiment. The surface tension of the solution was significantly decreased. The critical micelle concentration ofSapindussaponin powder composite with 10% inoculum was reduced from 10g/L to 2.5g/L，and surface tension was 18.67% lower than Sapindus saponin powder without inoculum. The composite product had good foaming properties and high foam stability.

Sapindus mukurossisaponin water extraction；rhamnolipid；fermentation refining process；surface activity；foam property

TQ 423.3

A

1000-6613（2014）10-2739-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.036

2014-02-25；修改稿日期：2014-03-26。

國家林業(yè)局重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2012-03）、國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃（201310022037）及“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD36B01）項(xiàng)目。

付堯（1994—），女，本科。聯(lián)系人：蔣建新，教授，博士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)能源及生物質(zhì)資源利用研究。E-mail jiangjx@ bjfu.edu.cn。