利多卡因?qū)Ρ掣?jié)神經(jīng)元誘發(fā)簇放電的影響及機(jī)制

孫 濤宋 英雷 振

實(shí)驗(yàn)研究

利多卡因?qū)Ρ掣?jié)神經(jīng)元誘發(fā)簇放電的影響及機(jī)制

孫 濤1，2宋 英3雷 振4△

目的 探討低濃度利多卡因?qū)β员掣?jié)壓迫（CCD）模型大鼠背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元誘發(fā)簇放電（EB）的影響及電流機(jī)制。方法24只SD大鼠分為正常對(duì)照組和CCD組，每組12只。CCD組用小鋼柱在左側(cè)腰4、5背根節(jié)行慢性壓迫，正常對(duì)照組未做任何處理。應(yīng)用在體細(xì)胞內(nèi)技術(shù)記錄2組大鼠EB放電的發(fā)生率及利多卡因?qū)﹂撓履る娢徽袷幍挠绊懀秒x體全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄不同濃度利多卡因?qū)Τ掷m(xù)性鈉電流（INaP）的影響。結(jié)果CCD 組EB發(fā)生率增高，達(dá)45.97％（57/124），和正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.810,P＜0.01）；DRG局部給予低濃度（50 μmol/L）利多卡因抑制INaP，致閾下膜電位振蕩幅度抑制，進(jìn)而影響EB發(fā)生。結(jié)論低濃度利多卡因通過阻斷INaP抑制EB放電而發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用。

神經(jīng)元；利多卡因；背根節(jié)神經(jīng)元；誘發(fā)簇放電；鈉電流

觸誘發(fā)痛是神經(jīng)病理性疼痛的常見癥狀，目前臨床上缺乏有效治療方法[1]。研究顯示外周神經(jīng)損傷后，損傷區(qū)域及相應(yīng)的背根節(jié)（DRG）Aβ神經(jīng)元胞體興奮性增高及產(chǎn)生的異位自發(fā)放電活動(dòng)，可能是觸誘發(fā)痛的直接原因[2]，但其參與觸誘發(fā)痛發(fā)生的確切機(jī)制還不清楚。本課題組已經(jīng)在慢性背根節(jié)壓迫（CCD）模型大鼠DRG的Aβ神經(jīng)元記錄到一種放電模式，命名為誘發(fā)簇放電（evoked-bursting，EB）[3]，推測(cè)其可能是觸誘發(fā)痛的電信號(hào)。利多卡因靜脈或口服給藥可用于治療神經(jīng)病理痛，但會(huì)有惡心、嘔吐、眩暈等不良反應(yīng)。本研究主要應(yīng)用電生理學(xué)方法，觀察低濃度利多卡因?qū)RG神經(jīng)元EB放電的影響，探討其能否作為抑制觸誘發(fā)痛的外周鎮(zhèn)痛藥物。

1 材料與方法

1.1 主要溶液與試劑 人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF，mmol/L）：NaCl 125、KCl 3.8、NaH2PO31.2、NaHCO326、葡萄糖10、MgCl21.0、CaCl22.0，pH 7.4；電極內(nèi)液（mmol/L）：葡糖酸鉀115、KCl 25、NaCl 9、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）10、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）0.2、MgCl21、K2-ATP 3，pH 7.4；測(cè)持續(xù)性鈉電流（persistent sodium cur-rent，INaP）電極內(nèi)液（mmol/L）：氟化銫130、NaCl 9、HEPES 10、EGTA 10、MgCl21、K2-ATP 3，pH 7.4；測(cè)INaP灌流液（mmol/L）：NaCl 131、HEPES10、KCl 3、葡萄糖10、CaCl21、MgCl22、氯化四乙胺（TEA-Cl）10、氯化銫10、4-氨基吡啶3、氯化鎘0.3，pH 7.4；消化液含人工腦脊液100 mL，蛋白酶40 mg，膠原酶100 mg；蛋白酶、膠原酶、HEPES、EGTA、K2-ATP、利多卡因均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及模型建立分組 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量180～250 g。將24只SD大鼠分為2組：正常對(duì)照組12只，CCD模型組12只。CCD組腹腔注射1％戊巴比妥鈉40 mg/ kg麻醉，手術(shù)暴露左側(cè)L4和L5椎間孔，將直徑0.4 mm，長(zhǎng)4 mm“L”型不銹鋼柱插入孔內(nèi)，對(duì)相應(yīng)DRG形成穩(wěn)定壓迫。術(shù)畢切口處用青霉素抗感染，逐層縫合肌肉和皮膚。正常對(duì)照組未做任何處理。

1.3 機(jī)械痛敏行為學(xué)測(cè)試 2組大鼠均進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試前大鼠在測(cè)試籠內(nèi)適應(yīng)30 min，室溫控制在（20±2）℃，再按刺激強(qiáng)度遞增順序依次施加Von Frey纖維細(xì)絲（1～26 g）至大鼠足底中心，以細(xì)絲稍微彎曲作為完全受力標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)測(cè)量5次，間隔15 s，5次檢查過程中抬腿次數(shù)≥3次的值為機(jī)械縮足反射閾值（paw withdraw threshold，PWT）。

1.4 在體細(xì)胞內(nèi)記錄 2組大鼠術(shù)后2～8 d在17.0％烏拉坦及1.0％α-氯醛糖復(fù)合麻醉藥腹腔注射麻醉下（5.0 mL/kg），常規(guī)手術(shù)暴露L4和L5 DRG，用脊柱固定器將大鼠固定，提起切口周圍皮膚及筋膜做一灌流槽，充灌ACSF，撕除DRG表面被膜，在顯微鏡下，將尖端電阻40～60 MΩ，內(nèi)充3 mol/L乙酸鉀的玻璃微電極刺入胞內(nèi)，記錄信號(hào)經(jīng)AxoClamp-700A放大器采集輸入計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)。觀察利多卡因?qū)B作用時(shí)選取1 200 ms時(shí)間段的閾下膜電位振蕩（SMPO）進(jìn)行傅里葉變換分析（FFT），觀察藥物的作用。

1.5 離體膜片鉗記錄 2組大鼠術(shù)后2～8 d經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg/kg），暴露L4和L5 DRG，取出帶外周神經(jīng)DRG至于ACSF，剝除表面被膜，在消化液中消化45 min，取出孵育1 h后移至記錄槽，壓片固定，吸引電極固定游離的神經(jīng)末端。在顯微鏡下用電阻為4～8 MΩ，充灌電極內(nèi)液玻璃微電極進(jìn)行巨阻封接，破膜后形成全細(xì)胞記錄模式。在檢測(cè)INaP時(shí)需采用二次鉗制方法：首先形成全細(xì)胞記錄，檢測(cè)細(xì)胞放電模式，更換電極，充灌測(cè)INaP電極內(nèi)液，再次鉗制，同時(shí)細(xì)胞外液置換測(cè)鈉外液，在電壓鉗測(cè)量INaP。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 CCD組術(shù)后24 h術(shù)側(cè)后肢出現(xiàn)觸誘發(fā)痛現(xiàn)象，PWT術(shù)后開始下降，此敏化狀態(tài)持續(xù)至術(shù)后10 d，而正常對(duì)照組大鼠同側(cè)后肢PWT在持續(xù)的檢測(cè)過程中沒有明顯改變，2組術(shù)后各時(shí)點(diǎn)組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Paw withdraw threshold test in normal control and CCD groups of rats表1 正常對(duì)照組和CCD組大鼠機(jī)械縮足閾值測(cè)試（n=12，g，±s）

Tab.1 Paw withdraw threshold test in normal control and CCD groups of rats表1 正常對(duì)照組和CCD組大鼠機(jī)械縮足閾值測(cè)試（n=12，g，±s）

＊＊P＜0.01

組別正常對(duì)照組CCD組t術(shù)前1 d 14.17±1.94 13.75±2.26 0.484術(shù)后1 d 14.58±1.44 3.10±2.03 15.962＊＊術(shù)后2 d 15.00±0.00 2.55±1.35 31.724＊＊組別正常對(duì)照組CCD組t術(shù)后4 d 14.58±0.41 2.71±1.80 23.587＊＊術(shù)后6 d 12.50±2.61 2.96±1.75 10.503＊＊術(shù)后10 d 13.75±2.26 4.25±2.17 10.478＊＊

2.2 EB放電發(fā)生率 正常對(duì)照組外周感受野給予輕觸刺激，在DRG Aβ神經(jīng)元記錄到離散、動(dòng)作電位間期不規(guī)則的多個(gè)放電，刺激停止后，放電中止；坐骨神經(jīng)電刺激在DRG只記錄到1個(gè)動(dòng)作電位，見圖1。CCD組，外周感受野觸刺激誘發(fā)部分Aβ神經(jīng)元胞體產(chǎn)生高頻簇放電（＞70 Hz），放電持續(xù)時(shí)程超出刺激時(shí)間；給予坐骨神經(jīng)電刺激（0.1 mA，0.05 ms）也可誘發(fā)胞體產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程的高頻簇放電（＞70 Hz），見圖1，即EB。正常對(duì)照組EB的出現(xiàn)率僅為14.55％（16/110）；CCD組術(shù)后Aβ神經(jīng)元EB出現(xiàn)率達(dá)45.97％（57/124），和正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.810,P＜0.01）。

Fig.1 The reactive mode of DRG neurons to stimuli applied on peripheral receptive field in normal and CCD groups圖1 正常對(duì)照組和CCD組DRG神經(jīng)元對(duì)外周感受野刺激的反應(yīng)模式

2.3 利多卡因?qū)B影響及電流機(jī)制 在記錄液槽中加入利多卡因1滴（10 μL），液槽內(nèi)終濃度為50 μmol/L，3 min后可見EB串長(zhǎng)減小，5 min后EB完全消除，但坐骨神經(jīng)刺激誘發(fā)的首個(gè)動(dòng)作電位不受影響，洗脫后10 min EB部分恢復(fù)（n＝5），對(duì)膜電位沒有顯著影響，見圖2A。圖2B顯示加藥后3、4、5 min局部膜電位的放大圖，圖中可見SMPO，F(xiàn)FT分析顯示此濃度利多卡因主要影響振蕩幅值，而對(duì)振蕩頻率沒有顯著影響，見圖2C。

更換外液及電極內(nèi)液后對(duì)EB神經(jīng)元二次鉗制，測(cè)量INaP，在-60 mV膜電位水平，給予胞體從-80～0 mV，時(shí)程為3 s的去極化斜波刺激，細(xì)胞在去極化刺激過程中出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)程內(nèi)向持續(xù)電流，在-55 mV左右被激活，-35 mV左右達(dá)峰值，即INap。利多卡因在1 μmol/L時(shí)可以將INaP的峰值抑制（29.00±7.70）％ （n=6），且有濃度依賴性，在應(yīng)用10及50 μmol/L利多卡因?qū)NaP的抑制程度分別為（65.71±6.76）％（n= 5）和（90.30±4.96）％（n=4），見圖3。

Fig.2 The effects of lidocaine on EB firing and SMPO圖2 利多卡因?qū)B放電及SMPO的作用

Fig.3 The effects of lidociane on INaPof EB neurons圖3 利多卡因?qū)B神經(jīng)元INaP的影響

3 討論

3.1 利多卡因的臨床應(yīng)用 利多卡因是臨床常用的局部麻醉藥，靜脈全身給藥可以用于治療慢性痛綜合征[4]，但因心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)未能廣泛應(yīng)用。近年來臨床運(yùn)用利多卡因治療神經(jīng)病理痛獲得了很大的關(guān)注，但是其作用機(jī)制尚不清楚。

3.2 背根節(jié)EB放電參與觸誘發(fā)痛的發(fā)生 觸誘發(fā)痛是神經(jīng)病理性疼痛的常見癥狀，產(chǎn)生機(jī)制不清，目前臨床上缺乏有效治療方法，是疼痛研究領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)難點(diǎn)[1]。本研究在前期CCD大鼠DRG神經(jīng)元記錄到一種由外周刺激誘發(fā)胞體產(chǎn)生的長(zhǎng)時(shí)程簇放電，即EB，該放電模式有效地放大了外周傳入的電信號(hào)，能有效增強(qiáng)脊髓背角突觸傳遞效率，契合了臨床輕觸刺激誘發(fā)劇烈、電擊樣觸誘發(fā)痛的感覺特征，推測(cè)可能是觸誘發(fā)痛的外周痛信號(hào)[3]。而且DRG處于血腦屏障之外，如果能在DRG局部使用利多卡因干擾EB放電，不但能抑制慢性痛信號(hào)發(fā)生，而且能避免全身給藥帶來的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)。

3.3 EB與SMPO的關(guān)系 SMPO是受損DRG神經(jīng)元出現(xiàn)的膜電位周期性波動(dòng)，是DRG神經(jīng)元異位自發(fā)放電產(chǎn)生的必要條件[5-6]。本研究結(jié)果顯示EB的發(fā)生與SMPO密切相關(guān)，50 μmol/L利多卡因可以通過抑制SMPO而抑制EB放電的發(fā)生，但外周刺激誘發(fā)的首個(gè)動(dòng)作電位的傳導(dǎo)沒有影響，即不影響正常外周動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[2]一致。

3.4 利多卡因外周鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制 神經(jīng)病理性痛情況下DRG神經(jīng)元產(chǎn)生SMPO的機(jī)制與電壓依賴性鈉電流和鉀電流之間的平衡有關(guān)[7]。電壓依賴性的INap可以影響神經(jīng)元的靜息膜電位水平，使之向去極化方向漂移，參與SMPO的產(chǎn)生，從而增大神經(jīng)元對(duì)閾下刺激反應(yīng)的敏感性。本研究結(jié)果顯示，利多卡因明顯降低EB神經(jīng)元的INap，推測(cè)DRG局部給予低濃度利多卡因可通過阻斷INap抑制SMPO的幅度，進(jìn)而抑制EB放電模式，從而發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用。

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（2014-04-23收稿 2014-06-24修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effects and Mechanism of Lidocaine on Evoked-Bursting Firing of Injured Dorsal Root Ganglion Neurons

SUN Tao1,2,SONG Ying3,LEI Zhen4△
1Liaoning Medical College,Liaoning 121000,China;2The Xingcheng Sanatorium of Shenyang Military Region;3Department of Anesthetic Physiology,Xuzhou Medical College;4First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College
△

E-mail:leizhen2004@163.com

ObjectiveTo study the effects and current mechanism of low concentration of lidocaine on evokedbursting(EB)firing of dorsal root ganglion(DRG)neurons in rat model of chronic compression(CCD)of DRG．MethodsTwenty-four SD rats were divided into normal control group(n=12)and CCD model group(n=12).CCD group was treated with chronic oppression on L4 and L5 DRG with L shape bar.Normal control group

no treatment.In vivo intracellular recording was used to record the incidence of EB and the effect of lidocaine on subthreshold membrane potential oscillation(SMPO).Patch clamp recording was used to record the effect of lidocaine on persistent sodium current(INaP).ResultsThe incidence of EB increased in CCD group(45.97％,57/124),which was significantly different when compared with normal group(χ2=26.810,P＜0.01).The magnitude of SMPO,INaPand EB were inhibited in a reversible way by lidocaine(50 μmol/L).ConclusionThe low concentration of lidocaine might play an analgesic effect in peripheral nervous system by selectively inhibiting INap,which participates in SMPO formation.

neurons；lidocaine；dorsal root ganglion neuron；evoked-bursting;sodium current

R338.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.005

國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200836）

1遼寧醫(yī)學(xué)院（郵編121000）；2沈陽軍區(qū)興城療養(yǎng)院；3徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院；4遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

△通訊作者 E-mail:leizhen2004@163.com