黃芪多糖誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子的影響

荊雪寧邱 波戰(zhàn)文翔武繼彪

黃芪多糖誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子的影響

荊雪寧1邱 波2戰(zhàn)文翔1武繼彪1

目的 探討黃芪多糖誘導(dǎo)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）腫瘤疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源的DC，加入黃芪多糖誘導(dǎo)成熟，以S180腫瘤抗原致敏獲得DC腫瘤疫苗。建立S180荷瘤小鼠模型，分為模型組、環(huán)磷酰胺組、黃芪多糖組、細(xì)胞因子組，在荷瘤第5天和第10天分別給予相應(yīng)治療。荷瘤第12天摘取腫瘤組織、胸腺、脾臟稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)；ELISA法檢測(cè)小鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-4、干擾素（IFN）-γ水平。結(jié)果黃芪多糖組、細(xì)胞因子組的抑瘤率高于環(huán)磷酰胺組（64.25％、64.10％vs 35.11％），胸腺指數(shù)高于環(huán)磷酰胺組（1.69±0.26、1.74±0.38 vs 1.45±0.22），脾臟指數(shù)高于環(huán)磷酰胺組(5.44±0.76、5.31± 0.81 vs 3.54±0.52)，IL-4水平(ng/L)低于環(huán)磷酰胺組（15.66±2.57、14.72±4.84 vs 23.95±6.07），IFN-γ水平(ng/L)高于環(huán)磷酰胺組（16.54±3.71、17.20±2.03 vs 10.37±2.19），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗可有效發(fā)揮抑瘤作用，其機(jī)制可能與提高荷瘤小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)Th1/Th2失衡向Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞免疫偏移，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能有關(guān)。

黃芪多糖；樹(shù)突細(xì)胞；白細(xì)胞介素4；干擾素Ⅱ型；抑瘤率；胸腺指數(shù)；脾臟指數(shù)；Th1/Th2

黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是機(jī)體功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，捕獲抗原后可有效遞呈可溶性腫瘤抗原，激活靜息T細(xì)胞，在特異性抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。基于DC具有誘導(dǎo)初始免疫應(yīng)答、增強(qiáng)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力，選擇DC作為載體制備腫瘤疫苗被認(rèn)為是最具潛力的腫瘤免疫治療手段[1]。黃芪多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[2]，但是關(guān)于黃芪多糖對(duì)DC影響的研究較少。本研究以黃芪多糖代替腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）誘導(dǎo)小鼠來(lái)源的DC成熟，以S180腫瘤抗原致敏，制備DC腫瘤疫苗，通過(guò)對(duì)S180荷瘤小鼠進(jìn)行免疫治療，探討黃芪多糖誘導(dǎo)成熟的DC腫瘤疫苗的體內(nèi)抑瘤效果及機(jī)制，為開(kāi)拓中藥治療腫瘤的途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和瘤株 雄性昆明種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g。購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（魯）20090001。小鼠肛門(mén)肉瘤細(xì)胞S180購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要藥品和試劑 黃芪多糖，純度＞98％，天津賽諾制藥有限公司生產(chǎn)。環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司產(chǎn)品。RPMI1640，Gibco公司生產(chǎn)；胎牛血清，Hyclone公司生產(chǎn)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索寶來(lái)科技有限公司，Hanks液購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組白細(xì)胞介素-4（rmIL-4）、重組TNF-α（rmTNF-α）購(gòu)自PeproTech公司，小鼠IL-4、干擾素（IFN）-γ ELISA試劑盒購(gòu)自RayBiotech公司。FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD80、PE標(biāo)記大鼠抗小鼠CD86抗體購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC腫瘤疫苗的制備 （1）小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲取。昆明種小鼠用頸椎脫位法處死，浸入75％乙醇浸泡10 min。無(wú)菌環(huán)境取雙側(cè)股骨、脛骨，剝離附著的肌肉軟組織，用無(wú)血清RPMI1640沖洗，剪開(kāi)骨兩端，用1 mL注射器抽取無(wú)血清RPMI1640，插入骨髓腔反復(fù)沖洗至紅色變淺。將收集的骨髓沖洗液以1 500 r/min離心10 min。以RPMI1640培養(yǎng)液重懸骨髓細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲得小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞。（2）DC的體外誘導(dǎo)與鑒定。用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/mL，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每孔6 mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后吸出懸浮細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。向培養(yǎng)瓶加入含rmGM-CSF 100 μg/L、rmIL-4 100 μg/L、10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液6 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。第2天、第4天行半量換液，第5天分別加入黃芪多糖100 mg/L和rm TNF-α 20 μg/L誘導(dǎo)成熟。第7天收集2種方法誘導(dǎo)的DC細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，向細(xì)胞中加入FITC標(biāo)記的CD80和PE標(biāo)記的CD86抗體，終濃度為5 mg/L。4℃避光保存30 min。用PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。（3）負(fù)載S180腫瘤全抗原的DC疫苗的制備。離心收集S180腹水瘤小鼠腹水中的S180細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 108/mL，液氮反復(fù)凍融4次，制備成腫瘤完全抗原。各組DC培養(yǎng)的第8天，向培養(yǎng)體系加入S180腫瘤抗原0.2 mL，DC與腫瘤抗原的比例為1∶20(抗原的量按凍融前腫瘤細(xì)胞的量計(jì))。第9天，收集細(xì)胞，獲得負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/mL。

1.2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立及動(dòng)物分組 將小鼠肛門(mén)肉瘤S180細(xì)胞接種于小鼠腹腔，待腹部膨出時(shí)，抽取腹水，以生理鹽水稀釋?zhuān)M(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，于小鼠右腋筋膜下接種0.2 mL，每次接種40只。將荷瘤第5天的小鼠隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺組、黃芪多糖組、細(xì)胞因子組，每組10只。

1.2.3 荷瘤小鼠免疫治療 模型組腹腔注射生理鹽水0.2 mL，其余3組分別經(jīng)荷瘤部位和腹腔注射，環(huán)磷酰胺組注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，黃芪多糖組注射經(jīng)黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗0.2 mL，細(xì)胞因子組注射經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的DC疫苗0.2 mL。5 d后再注射1次。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo) （1）胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、抑瘤率。荷瘤第12天，頸椎脫位法處死小鼠。剝離小鼠胸腺、脾臟及腫瘤組織，用濾紙吸干并稱(chēng)質(zhì)量，分別計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及抑瘤率。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），抑瘤率（％）=（模型組平均瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100％。（2）IL-4、IFN-γ的檢測(cè)。荷瘤第12天，各組小鼠經(jīng)眼球摘除法采血，4℃靜置過(guò)夜，次日3 000 r/min離心10 min，收集血清，用ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-4、IFN-γ水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 DC的形態(tài)與表型鑒定 單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)規(guī)則呈球形，透光度好，細(xì)胞膜表面光滑。加入細(xì)胞因子后第3天，細(xì)胞呈半貼壁，部分細(xì)胞懸浮，體積增大，形狀不規(guī)則似星形、梭形，有少量突起。第5天，細(xì)胞變圓，有大量突起，可見(jiàn)不太規(guī)則的樹(shù)突狀外形。第7天，懸浮細(xì)胞增多，胞漿透明，胞體增大，有毛刺樣突起，呈典型的DC形態(tài)。見(jiàn)圖1。DC培養(yǎng)第7天，黃芪多糖組細(xì)胞表面CD80陽(yáng)性、CD86陽(yáng)性及CD80和CD86雙陽(yáng)性的表達(dá)率顯著高于細(xì)胞因子組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Fig.1 The morphology of DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide（×200）圖1 細(xì)胞因子和黃芪多糖誘導(dǎo)的DC形態(tài)（×200）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 細(xì)胞因子和黃芪多糖誘導(dǎo)的DC表面CD80、CD86表達(dá)情況 （n=10，％，±s）

Tab.1 Expressions of CD80 and CD86 on DC induced by cytokines and astragalus polysaccharide表1 細(xì)胞因子和黃芪多糖誘導(dǎo)的DC表面CD80、CD86表達(dá)情況 （n=10，％，±s）

＊P＜0.05

?

2.2 黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 環(huán)磷酰胺組、細(xì)胞因子組、黃芪多糖組的瘤體質(zhì)量低于模型組，抑瘤率分別為35.11％、64.10％、64.25％，黃芪多糖組瘤體質(zhì)量低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05），而與細(xì)胞因子組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與環(huán)磷酰胺組相比，黃芪多糖組、細(xì)胞因子組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著提高（P＜0.05），而黃芪多糖組與細(xì)胞因子組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各組荷瘤小鼠的瘤體質(zhì)量與免疫器官指數(shù)（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of tumor weight and immune organ index between four groups of mice表2 各組荷瘤小鼠的瘤體質(zhì)量與免疫器官指數(shù)（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05

組別模型組環(huán)磷酰胺組細(xì)胞因子組黃芪多糖組F或χ2瘤體質(zhì)量（g）2.011±0.032 1.305±0.018a0.722±0.015ab0.719±0.023ab33.052＊＊胸腺指數(shù)（mg/g）2.11±0.15 1.45±0.22a1.74±0.38ab1.69±0.26ab7.831＊脾臟指數(shù)（mg/g）4.77±0.36 3.54±0.52a5.31±0.81ab5.44±0.76ab11.324＊

2.4 黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠血清IL-4、IFN-γ水平的影響 與模型組比較，黃芪多糖組、細(xì)胞因子組小鼠血清IL-4水平顯著下降，IFN-γ水平明顯增加（P＜0.05）。黃芪多糖組與細(xì)胞因子組相比，IL-4、IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-4 and IFN-γ between four groups of mice表3 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05

組別模型組環(huán)磷酰胺組細(xì)胞因子組黃芪多糖組F IL-4 19.08±3.11 23.95±6.07a14.72±4.84a15.66±2.57a10.253＊＊IFN-γ 11.23±0.77 10.37±2.19 17.20±2.03ab16.54±3.71ab17.560＊＊

3 討論

黃芪多糖對(duì)肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，可以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤的作用。很多研究結(jié)果提示黃芪多糖可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]、促進(jìn)抗腫瘤細(xì)胞因子分泌[4]、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[5]、降低端粒酶活性[6]等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。鄧旻等[7]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖體可在體外誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞定向分化為成熟的DC，但關(guān)于黃芪多糖誘導(dǎo)的DC體內(nèi)抗腫瘤作用的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源的未成熟DC呈典型的DC形態(tài)，其表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86的表達(dá)顯著高于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的成熟DC，提示黃芪多糖可以有效誘導(dǎo)DC表達(dá)協(xié)同刺激分子，利于DC提呈抗原。用S180腫瘤全抗原致敏的DC腫瘤疫苗對(duì)S180荷瘤小鼠進(jìn)行免疫治療，結(jié)果顯示黃芪多糖組、細(xì)胞因子組小鼠的瘤體質(zhì)量低于模型組和環(huán)磷酰胺組，而胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著高于陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺組，與細(xì)胞因子組相比，黃芪多糖組的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異，提示黃芪多糖誘導(dǎo)的DC腫瘤疫苗在抗腫瘤的同時(shí)，能改善荷瘤小鼠的免疫功能。

Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤免疫中占有重要地位。正常情況下，Th1和Th2處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，并相互制約，以維持機(jī)體正常的免疫功能[8]。很多腫瘤患者體內(nèi)發(fā)生Th1細(xì)胞受到抑制而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象，即Th1/Th2漂移，機(jī)體的抗腫瘤免疫受到嚴(yán)重抑制[9]。目前尚無(wú)區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志物，通常以IFN-γ評(píng)判Th1細(xì)胞功能，IL-4評(píng)判Th2細(xì)胞功能。本研究顯示，黃芪多糖組、細(xì)胞因子組小鼠血清IFN-γ水平顯著升高，IL-4水平顯著下降，提示黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗能糾正荷瘤小鼠的Th1/Th2失衡，改善免疫狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫功能。

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(2014-05-10收稿 2014-06-30修回)

（本文編輯 閆娟）

The Inhibitory Effect of Dendritic Cell Tumor Vaccine Induced by Astragalus Polysaccharides on the Expression of Cytokines Th1/Th2 in S180 Tumor-Bearing Mice

JING Xuening1,QIU Bo2,ZHAN Wenxiang1,WU Jibiao1
1 Shandong College of Traditional Chinese Medicine,Yantai 264199，China;2 Yantai Central Hospital of Laiyang City

ObjectiveTo study the antitumor effects of dendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides on S180 tumor-bearing mice,and its possible mechanism.MethodsDendritic cells derived from mouse bone marrow were induced maturation by astragalus polysaccharides and loaded with S180 tumor antigen to prepare tumor vaccine.Tumor-bearing mice were divided into four groups and treated on day-5 and day-10 respectively.Group A was injected with NS,Group B with CTX(50 mg/kg),Group C with dendritic cells induced by astragalus polysaccharides and Group D with dendritic cells induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.After 12 days of tumor-bearing,the animals were killed.The subcutaneous sarcoma,thymus and spleen were separated and weighted.The inhibitory rate,thymus index and spleen index were then calculated.ELISA assay was used to detect the levels of interleukin(IL)-4,interferon(IFN)-γ in serum of tumor bearing mice.ResultsThe tumor inhibition rate was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(64.25％,64.10％vs 35.11％).The thymus index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(1.69±0.26,1.74±0.38 vs 1.45±0.22).The spleen index was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(5.44±0.76,5.31±0.81 vs 3.54±0.52).The level of IL-4 was lower in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(15.66±2.57,14.72±4.84 vs 23.95± 6.07).The level of IFN-γ was higher in astragalus polysaccharide group and cytokine group than that of CTX group(16.54± 3.71,17.20±2.03 vs 10.37±2.19).All the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionDendritic cell vaccine induced by astragalus polysaccharides can effectively inhibit tumor growth.Its mechanism may be associated with the promotion spleen index and thymus index of S180 tumor-bearing mice,the effective correction of Th1/Th2 imbalance induced by tumor,and the enhancement of antitumor immune responses.

astragalan；dendritic cells；interleukin-4；interferon typeⅡ；tumor inhibition rate；thymus index；spleen index；Th1/Th2

R730.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.007

山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2009-254）

1山東煙臺(tái)，山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校（郵編264199）;2煙臺(tái)市萊陽(yáng)中心醫(yī)院