人源性防御素HD-5的原核表達(dá)及抗真菌作用的初步研究

張萍萍 尹利榮△ 王 芳 孫 蓓 霍 彥

人源性防御素HD-5的原核表達(dá)及抗真菌作用的初步研究

張萍萍1尹利榮1△王 芳1孫 蓓2霍 彥3

目的 構(gòu)建pQE-30Xa/HD-5原核表達(dá)載體，純化重組蛋白并進(jìn)行抗真菌活性的初步鑒定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5為模板，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增編碼HD-5成熟肽的基因。構(gòu)建pQE-30Xa/HD-5重組表達(dá)載體，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、基因序列分析。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌M15后進(jìn)行異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。通過鎳柱親和層析純化蛋白并進(jìn)行蛋白復(fù)性，蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定純化產(chǎn)物。以KB紙片法初步驗(yàn)證純化獲得的重組蛋白對白色假絲酵母菌的抑菌活性。結(jié)果成功克隆了HD-5基因并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE-30Xa/HD-5。重組質(zhì)粒在大腸桿菌M15中誘導(dǎo)表達(dá)出HD-5融合蛋白；Western blot分析結(jié)果顯示純化后的融合蛋白與目的蛋白相符；KB紙片法證實(shí)純化后的融合蛋白對白色假絲酵母菌具有一定的抑菌活性。結(jié)論成功構(gòu)建HD-5原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后純化獲得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。

防御素類；重組融合蛋白質(zhì)類；大腸桿菌；防御素-5；原核表達(dá)；親和層析；抗真菌活性

近年來，隨著廣譜抗菌藥物、各類激素等的廣泛使用，外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis,VVC）的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率逐年升高，嚴(yán)重影響女性的身心健康。防御素因其相對分子質(zhì)量小、對熱穩(wěn)定、抗微生物范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性等明顯優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素的特點(diǎn)，成為抗生素替代的首選。防御素HD-5(human alpha-defensin 5)在女性生殖道上皮包括陰道、宮頸及輸卵管的上皮細(xì)胞均有表達(dá)與分泌。其與生殖道的感染性疾病密切相關(guān)也得到了證實(shí)[1]。但HD-5的來源少，提取困難，成為HD-5進(jìn)一步研究及應(yīng)用的瓶頸。近年來，國內(nèi)外學(xué)者雖通過真核表達(dá)體系獲得HD-5蛋白，但仍存在蛋白提純困難等問題。本研究通過原核表達(dá)體系對HD-5進(jìn)行融合表達(dá)與純化，并對融合蛋白的抗真菌活性進(jìn)行初步鑒定，為獲取HD-5活性蛋白提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為HD-5的進(jìn)一步研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株 pQE-30Xa質(zhì)粒、大腸桿菌M15菌株(E.coli M15)均為天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所保存。pcDNA3.1(+)/HD-5為天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所構(gòu)建并經(jīng)DNA序列分析正確。標(biāo)準(zhǔn)白色假絲酵母菌株ATCC-90028由北京中原公司從ATCC購進(jìn)。

1.1.2 主要試劑 KOD-Plus高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Kpn I和HindⅢ、T4 DNA連接酶、DNA Marker DL2000 Plus購自TaKaRa公司,小鼠抗His標(biāo)簽抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自中杉金橋生物公司。凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（Plasmid Mini Kit）購自O(shè)MEGA公司,鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)親和層析蛋白純化柱料購自GeneScript公司；一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒購自上海生工生物有限公司。其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 編碼HD-5成熟肽的基因克隆 根據(jù)GenBank上編碼HD-5成熟肽的基因（NM_021010.1），采用Gene runner軟件設(shè)計合成上下游引物，兩端分別加入了Kpn I和HindⅢ兩個酶切識別序列。陰影部分為酶切位點(diǎn)，引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。上游引物（p1）：5′-CGGGGTACCATGAGGACCATCGCC-3′；下游引物（p2）：5′-CCCAAGCTTGCGACAGCAGAGTCT-3′。以p1、p2為引物，pcDNA3.1(+)/HD-5為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)，72℃10 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后以1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達(dá)載體pQE-30Xa/HD-5的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pQE-30Xa與HD-5 PCR產(chǎn)物分別用Kpn I和HindⅢ進(jìn)行雙酶切后以T4 DNA連接酶于37℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli M15，挑取氨芐青霉素(Amp)篩選的陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定及測序分析。

1.2.3 融合蛋白fHD-5的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將構(gòu)建正確的pQE-30Xa/HD-5質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入E.coli M15感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單菌落至加入終濃度為1 g/L的Amp+的液態(tài)培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后1∶100轉(zhuǎn)接，37℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600約0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，收集菌體。通過一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒回收上清液及沉淀，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳。以含空白pQE-30Xa質(zhì)粒的E.coli M15宿主菌和未誘導(dǎo)的含pQE-30Xa/HD-5宿主菌為對照。

1.2.4 融合蛋白fHD-5的純化、復(fù)性及Western blot鑒定 采用Ni-NTA親和層析進(jìn)行融合蛋白的純化。將包涵體儲備液溶于適量溶解緩沖液，去除雜質(zhì)加入平衡后的層析柱中，沖洗液漂洗后，對融合蛋白進(jìn)行柱上復(fù)性，復(fù)性緩沖液尿素起始濃度為6 mol/L，終止?jié)舛葹? mol/L。最后以洗脫液進(jìn)行線性洗脫，洗脫液中咪唑起始濃度為20 nmol/L，終止?jié)舛葹?00 nmol/L。所有步驟均在?KTAprime蛋白層析純化系統(tǒng)上進(jìn)行。對收集液行15％SDS-PAGE檢測分析。純化蛋白行15％SDS-PAGE電泳后，濕法轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，封閉2 h，加入小鼠抗His標(biāo)簽抗體，于4℃搖床過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，于37℃孵育2 h，洗膜后ECL法顯色。

1.2.5 融合蛋白fHD-5抗真菌活性的檢測 采用KB紙片擴(kuò)散法測定純化后的融合蛋白fHD-5的抗真菌活性。制備對數(shù)生長期的白色假絲酵母菌菌液（孢子含量105CFU/mL）。取100 μL均勻涂布于沙氏平板上。取直徑1 cm的無菌濾紙片浸泡于fHD-5溶液中，制備KB紙片。將浸泡過fHD-5溶液的濾紙片平鋪于涂菌的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。以浸泡PBS緩沖液的濾紙片為陰性對照組。

2 結(jié)果

2.1 編碼HD-5成熟肽的基因克隆 PCR擴(kuò)增出清晰目的條帶，長度約250 bp與預(yù)期的人HD-5基因大小一致，見圖1。

Fig.1 Recombinant plasmid confirmed by PCR圖1 表達(dá)載體PCR電泳鑒定

2.2 pQE-30Xa/HD-5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切后，獲得長度約3 000 bp、250 bp的2條片段，與預(yù)期相符，見圖1。DNA序列分析結(jié)果證實(shí)pQE-30Xa載體中插入大小為243 bp的基因片段與HD-5基因序列一致。

2.3 融合蛋白fHD-5的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 含重組質(zhì)粒pQE-30Xa/HD-5質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌在37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，其沉淀在11 ku處出現(xiàn)一明顯的深染條帶?？蛰d體誘導(dǎo)表達(dá)后和重組未誘導(dǎo)菌在11 ku處無明顯條帶出現(xiàn)，見圖2。初步證實(shí)，誘導(dǎo)后的重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。

Fig.2 HD-5 expression was confirmed by SDS-PAGE圖2 pQE-30Xa/HD-5重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

2.4 融合蛋白fHD-5純化產(chǎn)物鑒定 Western blot證實(shí)純化后的融合蛋白于11 ku處有一條清晰條帶，與預(yù)期的目的蛋白相符。見圖3。

Fig.3 Purification confirmed by Western Blot圖3 純化產(chǎn)物Western Blot鑒定

2.5 融合蛋白fHD-5抗真菌活性的初步鑒定 浸泡過fHD-5溶液的濾紙片周圍可見明顯抑菌圈，而陰性對照組則無抑菌圈出現(xiàn)，見圖4。

Fig.4 Antifungal activity examined by disk diffusion圖4 KB紙片法檢測fHD-5抗真菌活性

3 討論

哺乳動物的防御素不但具有抗細(xì)菌、真菌及被膜病毒的活性，還對支原體、衣原體、螺旋體及艾滋病病毒具有殺傷作用。此外，防御素作為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在天然免疫中發(fā)揮重要作用的同時，也介導(dǎo)、調(diào)節(jié)著機(jī)體的獲得性免疫[2]。由于HD-5的廣譜抗微生物活性及其分布的特殊性，越來越多的學(xué)者認(rèn)為HD-5與生殖道的感染性疾病密切相關(guān)。目前HD-5抗微生物活性的具體機(jī)制尚不明確，大多研究認(rèn)為，其主要的抗微生物活性可能與其所帶電荷有關(guān)，HD-5與微生物的細(xì)胞膜特異位點(diǎn)接觸后形成電壓依賴通道，使細(xì)胞離子通透性失衡，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。防御素與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制不同，可有效避免微生物耐藥性的產(chǎn)生，應(yīng)用前景良好。

天然的防御素來源少，提取困難，使得防御素的深入研究及應(yīng)用受到限制。直接從組織中提出操作困難且獲量少，化學(xué)合成成本昂貴，基因工程則成為防御素合成的必然選擇。鑒于防御素的獨(dú)特抗菌活性，建立能夠高效表達(dá)且易于快速分離純化的基因工程表達(dá)體系，將為防御素等天然抗菌肽的自動化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。已有研究通過酵母表達(dá)體系成功的構(gòu)建了HD-5的真核表達(dá)體系并進(jìn)行相關(guān)研究[4]。真核表達(dá)系統(tǒng)雖然可以實(shí)現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及翻譯后的后期加工過程，但表達(dá)水平一般較低，分離純化困難，從而限制了HD-5的深入研究。

外源基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)是目前普遍采用的一種高效表達(dá)方式。本研究采用pQE30作為HD-5的表達(dá)載體，利用載體自帶的T5啟動子，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)。pQE30載體在重組蛋白N端融合表達(dá)有6個連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽（6*His-Tag）。6*His-Tag與細(xì)菌的翻譯轉(zhuǎn)錄機(jī)制互相兼容，利于蛋白的表達(dá)，并且對目的蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)沒有明顯影響，通過His標(biāo)簽融合表達(dá)的蛋白可以采用固定化金屬離子親和層析純化目的蛋白，使操作十分簡便[5]。E.coli M15菌株是與pQE30表達(dá)載體相互匹配的用于表達(dá)外源蛋白的宿主菌，其基因組內(nèi)插入了真核生物稀有密碼子相應(yīng)的tRNA基因。利用該菌株能更有效地表達(dá)目的蛋白。本研究證實(shí)，HD-5融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，可以有效地防止蛋白酶對目的蛋白的溶解，降低胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)產(chǎn)量的提高；包涵體中雜質(zhì)蛋白含量低，有利于進(jìn)一步的分離純化。同時包涵體蛋白不具有生理活性，有效降低了HD-5對宿主菌的毒性作用，有利于進(jìn)一步提高表達(dá)產(chǎn)量。包涵體蛋白需進(jìn)行變性條件下的純化，純化后需對蛋白進(jìn)行復(fù)性。本研究通過NI-NTA親和層析純化目的蛋白，并進(jìn)行蛋白復(fù)性后，獲得了純度較高的HD-5融合蛋白。對融合蛋白進(jìn)行抗真菌活性的驗(yàn)證結(jié)果顯示含有6*His-Tag的融合蛋白對白色假絲酵母菌具有明顯的抑制作用。相關(guān)研究也證實(shí)，His-Tag的存在對抗菌肽的抑菌活性并無明顯影響[6]。因此，利用該重組表達(dá)體系，可以獲得具有生物活性的HD-5蛋白，還可以通過對誘導(dǎo)條件的不斷優(yōu)化，進(jìn)一步提高目的蛋白的產(chǎn)量，進(jìn)而滿足HD-5深入研究的需求，并為新型抗菌藥物大規(guī)模生產(chǎn)途徑的選擇提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。HD-5融合蛋白有效的抗真菌活性，更為婦科生殖道感染性疾病的治療開拓了新的研究方向。

[1]Simms LA,Doecke JD,Walsh MD,et al.Reduced alpha-defensin expression is associated with inflammation and not NOD2 mutation status in ileal Crohn’s disease[J].Gut,2008,57(7):903-910.doi：10.1136/gut.2007.142588.

[2]Wiesner J,Vilcinskas A.Antimicrobial peptides:the ancient arm of the human immune system[J].Virulence,2010,1(5):440-464.doi: 10.4161/viru.1.5.12983.

[3]Lehrer RI,Lu W.α-Defensins in human innate immunity[J].Immunol Rev，2012,245(1):84-112.doi:10.1111/j.1600-065x.2011.01082.x.

[4]Hsu KH,Pei C,Yeh JY,et al.Production of bioactive human alphadefensin 5 in Pichia pastoris[J].J Gen Appl Microbiol，2009,55(5): 395-401.doi:10.2323/jgam.55.395.

[5]Ralph EC,Xiang LK,Cashman JR,et al.His-tag truncated butytylcholinesterase as a useful construct for in vitro characterization of wild-type and variant butyrylcholinesterases[J].Protein Expr Purif，2011，80(1):22-27.doi:10.1016/j.pep.2011.07.005.

[6]Lee KW,Han NS,Kim JH.Purification and characterization of beta-glucosidase from Weissella cibaria 37[J].J Microbiol Biotechnol, 2012,22(12):1705-1731.doi:10.4014/jmb.1206.06007.

（2013-10-09收稿 2014-03-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Prokaryotic Expression and Antifungal Activity of Human α Defensin-5 Protein

ZHANG Pingping1,YIN Lirong1,WANG Fang1,SUN Bei2,HUO Yan3
1 Department of Gynecology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China;2 Research Institute of Endocrinology of Tianjin Medical University;3 Department of Family Planning,the Second Hospital of Tianjin Medical University YIN Lirong,E-mail：yinlirongfk@sina.com

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression vector for HD-5 and purify the recombinant HD-5 protein then analyze its antifungal activity.MethodsThe HD-5 gene was cloned by PCR,then was inserted into prokaryotic expression plasmid pQE-30Xa to construct pQE-30Xa/HD-5.After sequencing,pQE-30Xa/HD-5 was transformed into E.coli M15 cells.Its expression was induced by IPTG and confirmed by SDS-PAGE.The recombinant protein was purified through Ni-NTA affinity purification system.The antifungal activity was tested by disk diffusion method.ResultsHD-5 gene and pQE-30Xa/HD-5 vector were obtained successfully.E.coli M15 strains was used to express HD-5 fusion protein. After purification,the fusion protein was confirmed by Western blot.The disk diffusion test confirmed that the fusion protein can inhibit Candida albicans.ConclusionExpression vector pQE-30Xa/HD-5 was successfully constructed.The HD-5 fusion protein was expressed in E.coli successfully,which showed a certain degree of antifungal activity.

defensins;recombinant fusion proteins;Escherichia coli;human alpha defensin 5；prokaryotic expression；affinity purification；antifungal activity

R711.3,R349.65

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.006

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科（郵編300211）；2天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所；3天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計劃生育科

△通訊作者 E-mail：yinlirongfk@sina.com