SYBR Green實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法檢測(cè)端粒酶活性

麻文青 連福治 汪金泉 楊 磊,△

SYBR Green實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法檢測(cè)端粒酶活性

麻文青1連福治2汪金泉3楊 磊1,2△

目的 采用實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（RQ-TRAP法）檢測(cè)不同細(xì)胞端粒酶活性。方法用RQTRAP和TRAP-ELISA兩種方法同時(shí)檢測(cè)12種細(xì)胞的端粒酶活性，并比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果RQ-TRAP方法能準(zhǔn)確特異地檢測(cè)系列稀釋的293T細(xì)胞蛋白提取液的端粒酶活性，靈敏度可達(dá)8個(gè)細(xì)胞，擴(kuò)增效率為98.92％。陰性對(duì)照組則未檢測(cè)到端粒酶活性。RQ-TRAP方法測(cè)得12個(gè)細(xì)胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA方法結(jié)果有較強(qiáng)相關(guān)性（r2=0.762 5）。兩種方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性均高于正常細(xì)胞。結(jié)論RQ-TRAP方法檢測(cè)端粒酶可行，比TRAP-ELISA方法成本低、時(shí)間短，且支持高通量，是一種新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

端粒；基因擴(kuò)增；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；端粒酶活性；端粒重復(fù)序列擴(kuò)增；TRAP-ELISA

端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合體[1]。在絕大多數(shù)永生化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性較高[2]。因此，端粒酶可能為腫瘤的診斷和治療提供新的方向[3]。目前端粒酶活性的檢測(cè)主要采用TRAP-ELISA 法[4]。但是該法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本相對(duì)較高等缺點(diǎn)。近年來，有研究將定量PCR與TRAP法結(jié)合起來，采用熒光染料SYBR Green，建立了SYBR Green實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（RQ-TRAP法）[5]。本實(shí)驗(yàn)采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA法檢測(cè)不同細(xì)胞端粒酶活性，旨在證實(shí)RQ-TRAP法的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 細(xì)胞由本室保存及其他實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和新生胎牛血清均為Hy-Clone產(chǎn)品，TRAP-ELISA端粒酶檢測(cè)試劑盒TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS購(gòu)于Roche公司；RQ-TRAP引物參照文獻(xiàn)序列如下：TS 5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，ACX 5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。SYBR Green實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，所用定量PCR儀為Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 所選細(xì)胞包括人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞、人腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC-12細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞、人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞系U937細(xì)胞和人卡巴式肉瘤相關(guān)皰癥病毒感染細(xì)胞系BCBL-1細(xì)胞，以及人肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系D407細(xì)胞和鼠成纖維細(xì)胞系L929細(xì)胞。Jurkat細(xì)胞、U937細(xì)胞、BCBL-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，其他細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)在含10％新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，所有細(xì)胞均在37℃、5％CO2和95％相對(duì)濕度條件下孵育培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。

1.3 細(xì)胞蛋白提取液的制備 RQ-TRAP用細(xì)胞蛋白提取液按Kim法制備：收集細(xì)胞，PBS沖洗1次，10 000×g4℃離心1 min收集細(xì)胞，沉淀細(xì)胞用預(yù)冷的洗液[10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸氫氧化鉀（Hepes-KOH，pH 7.5），1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）]重懸，再離心，重懸1×104～1×106個(gè)細(xì)胞在20 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液里[10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5 mmol/L β-巰基乙醇，0.5％3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS），10％甘油]。冰上孵育30 min，16 000×g4℃離心20 min，收集上清，迅速冷凍，-80℃保存。TRAP-ELISA用細(xì)胞蛋白提取液制備方法按照TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS（Roche Molecular Biochemicals）試劑盒說明制備。取5 μL的細(xì)胞提取液加入2 μL DNase-free RNase（0.5 g/L），37℃孵育20 min以滅活端粒酶，作為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。

1.4 RQ-TRAP檢測(cè)端粒酶活性 依照參考文獻(xiàn)[5]檢測(cè)RQTRAP端粒酶活性，定量PCR采用Takara SYBR PremixEx TaqTM實(shí)時(shí)定量試劑盒（Takara DRR041A）。取5倍系列稀釋的端粒酶陽性的293T細(xì)胞提取液（1 000、200、40、8個(gè)細(xì)胞），以及2種陰性對(duì)照樣本分別作為PCR模板同時(shí)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。2種陰性對(duì)照按照如下方法設(shè)立。（1）以裂解液替代細(xì)胞提取液，用以監(jiān)測(cè)PCR過程是否有污染。（2）RNase處理后，端粒酶RNA模板被降解，作為檢測(cè)樣本的自身對(duì)照。定量PCR反應(yīng)體系（20μL）為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，PCR Forward Prime TS（10μmol/L）0.8μL，PCR Reverse Prime ACX（10μmol/L）0.4μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板（細(xì)胞提取液）1μL。PCR反應(yīng)程序包括：（1）端粒延長(zhǎng)，25℃孵育20 min。（2）端粒酶滅活，95℃5 min。（3）擴(kuò)增循環(huán)，95℃變性5 s，60℃退火/延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用ABI7300軟件采集和分析數(shù)據(jù)，通過軟件可以計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品和所有樣品達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)（Ct），以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)軸，Ct值為縱坐標(biāo)軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 000個(gè)細(xì)胞制備的細(xì)胞提取液進(jìn)行樣品檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法為每個(gè)樣品相對(duì)于同樣細(xì)胞數(shù)293T細(xì)胞的端粒酶活性的比值。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.5 TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性 參照Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS試劑盒及文獻(xiàn)操作說明進(jìn)行操作。收集培養(yǎng)的活力良好的細(xì)胞并計(jì)數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞，冷PBS洗2次，加裂解液200μL，冰上裂解30 min， 16 000×g低溫離心20 min，取上清3μL加入TRAP反應(yīng)液并加無核酸酶的水補(bǔ)足50μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，平行對(duì)照組于檢測(cè)前經(jīng)RNase處理。反應(yīng)條件為：引物延長(zhǎng)25℃30 min；端粒酶滅活94℃5 min；擴(kuò)增條件：變性94℃30 s；退火50℃30 s；延伸72℃90 s循環(huán)30次。取2.5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，每個(gè)樣品加10μL變性液，室溫反應(yīng)10 min，加雜交液100μL，充分混勻，將上述混合液體加入到鏈霉親和素包被的微量反應(yīng)板中，300 r/min 37℃孵育2 h；棄去雜交液,輕輕地用沖洗緩沖液清洗3次，向每孔中加入100μL抗地高辛過氧化物酶，300 r/min搖床室溫30 min；棄去液體，用沖洗緩沖液清洗5次，加100μL TMB底物液，室溫下觀察顏色反應(yīng)。端粒酶陽性時(shí)，液體由無色透明逐漸變藍(lán)，加入終止液，顏色由藍(lán)變黃。加入終止液后30 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm處吸光度值，參考波長(zhǎng)為690 nm。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法的關(guān)聯(lián)性用線性回歸模型分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RQ-TRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線 4個(gè)濃度的293T細(xì)胞提取液均檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，而2種陰性對(duì)照均沒有檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。隨著模板濃度的降低，Ct值隨著增大，但在8個(gè)細(xì)胞的裂解液中也能有效地檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖1A。PCR產(chǎn)物的熔解曲線顯示為單峰，沒有引物二聚體的形成，見圖1B。PCR結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示擴(kuò)增斜率為-3.34，決定系數(shù)（R2）達(dá)到0.997，擴(kuò)增效率為98.92％。

Fig.1 The standard curve of telomerase activity measured by RQ-TRAP圖1 RQ-TRAP測(cè)定端粒酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 RQ-TRAP與TRAP-ELISA檢測(cè)端粒酶活性結(jié)果比較 兩種方法測(cè)得12種細(xì)胞的相對(duì)端粒酶活性，見表1。兩種方法測(cè)得的端粒酶活性存在相關(guān)性（r2=0.762 5，P＜0.05）。端粒酶活性結(jié)果還顯示，兩種方法測(cè)得的腫瘤細(xì)胞端粒酶活性均高于正常細(xì)胞。

Tab.1 Comparison of telomerase activity measured by RQ-TRAP and TRAP-ELISA表1 RQ-TRAP和TRAP-ELISA測(cè)得相對(duì)端粒酶活性比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增和SYBR Green熒光定量PCR相結(jié)合的SYBR Green實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)序列擴(kuò)增（RQ-TRAP）方法檢測(cè)端粒酶活性，以縮短操作時(shí)間、減少繁瑣的擴(kuò)增后操作步驟（如聚丙烯酰胺凝膠電泳或ELISA等）。實(shí)驗(yàn)采用Kim等[6]文獻(xiàn)報(bào)道的TS和ACX引物，無引物二聚體的形成。同時(shí)RQ-TRAP方法能準(zhǔn)確特異地檢測(cè)12種細(xì)胞的端粒酶活性，且在8個(gè)細(xì)胞濃度時(shí)仍能有效地檢測(cè)，顯示該方法具有較高靈敏度。同時(shí)，擴(kuò)增效率達(dá)98.92％，可高效率地檢測(cè)端粒酶活性。

目前，TRAP-ELISA檢測(cè)端粒酶活性方法較為常用，它具有靈敏、特異及可定量人端粒酶活性等優(yōu)點(diǎn)，但是仍存在擴(kuò)增后處理時(shí)間較長(zhǎng)，成本相對(duì)較高等問題。近年來，有研究將定量PCR與TRAP法結(jié)合起來，采用熒光染料SYBR Green建立了一種新的端粒酶活性檢測(cè)方法，即RQ-TRAP法。Wege等[5]研究認(rèn)為TRAP-ELISA與RQ-TRAP有相關(guān)性，且RQ-TRAP有耗時(shí)短、線性結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。另外Hou等[7]的研究也表明RQ-TRAP方法是一種新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。本實(shí)驗(yàn)將研究樣本增加到12個(gè)細(xì)胞系，包括腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系。利用RQ-TRAP和TRAP-ELISA方法同時(shí)檢測(cè)端粒酶活性，并對(duì)兩種方法進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：9個(gè)腫瘤細(xì)胞系的相對(duì)端粒酶活性均高于3個(gè)正常細(xì)胞系，這一結(jié)果與普遍認(rèn)為的腫瘤細(xì)胞有較高的端粒酶活性相一致。用RQ-TRAP方法測(cè)得12個(gè)細(xì)胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA結(jié)果相關(guān)性為r2=0.762 5，表明RQ-TRAP方法可以作為一種檢測(cè)端粒酶活性的方法，與TRAP-ELISA方法比較，它消除了擴(kuò)增后復(fù)雜的ELISA過程，縮減了時(shí)間和繁瑣的操作步驟，降低了成本，可以高通量進(jìn)行,提高了檢測(cè)效率，是一種可靠、能快速定量端粒酶活性的方法。

端粒酶在腫瘤組織中的檢出率為85％～95％，而在非腫瘤組織和各種正常組織中其檢出率為4％～6％[8]。本研究中3種正常細(xì)胞系的端粒酶活性均低于其他9個(gè)腫瘤細(xì)胞系，此結(jié)果符合目前研究成果，所以RQ-TRAP法是一種可靠地檢測(cè)端粒酶活性的方法。

[1]Qi A,Zhou H,Zhou Z,et al.Telomerase activity increased and telomere length shortened in peripheral blood cells from patients with immune thrombocytopenia[J].J Clin Immunol,2013,33(3):577-585. doi:10.1007/s10875-012-9848-z.

[2]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer[J].Eur J Cancer,1997,33(5):787-791.

[3]Holysz H,Lipinska N,Paszel-Jaworska A,et al.Telomerase as a useful target in cancer fighting-the breast cancer case[J].Tumour Biol,2013,34(3):1371-1380.doi:10.1007/s13277-013-0757-4.

[4]Huang KZ,Nie DN,Yin SM,et al.Cyclin D1,hTERT expression and telomerase activity in HL-60 and HL-60A cell lines and their significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(4): 911-915.

[5]Wege H,Chui MS,Le HT,et al.SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity[J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):E3-3.

[6]Kim NW,Wu F.Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP)[J].Nucleic Acids Res,1997,25(13):2595-2597.

[7]Hou M,Xu D,Bjorkholm M,et al.Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity[J].Clin Chem,2001,47(3):519-524.

[8]Gunes C,Rudolph KL.The role of telomeres in stem cells and cancer [J].Cell,2013,152(3):390-393.doi:10.1016/j.cell.2013.01.010.

（2014-02-21收稿 2014-03-31修回）

（本文編輯 魏杰）

Combined SYBR Green Real-Time with Telomeric Repeat Amplification Protocol(RQ-TRAP) to Detect Telomerase Activity

MA Wenqing1,LIAN Fuzhi2,WANG Jinquan3,YANG Lei1，2
1 Medical College，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2 Medical College，Hangzhou University;3 College of Life and Environmental Sciences,Shihezi University YANG Lei,E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn

ObjectiveTo establish methodology to detect telomerase activity based on real-time quantitative PCR technique combined with telomeric repeat amplification protocol(TRAP).MethodsRQ-TRAP system was developed by combining real-time quantitative PCR technique with conventional TRAP method.Telomerase activity was assessed and compared by RQ-TRAP assay and TRAP connected with enzyme-linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA)respectively in 12 kinds of cells.ResultsThe RQ-TRAP method was both accurate and specified in measuring telomerase activity in a series dilution of protein extracts from 293T cells.The sensitivity of this method was 8 cells and the amplification efficiency was 98.92％.Telomerase activity was not detected in negative control group.Statistical analysis revealed a strong correlation between the two assays(r2=0.762 5).ConclusionThe feasibility of RQ-TRAP was proved in this article.Compared with TRAP-ELISA,RQ-TRAP has many advantages.Apart from sample extraction and real-time PCR cycling,no other extra time-consuming steps are needed for telomerase quantification；RQ-TRAP is less costly and more rapid and reliable than TRAP-ELISA for quantification of telomerase activity and it also support high throughput.

telomere;gene amplification;enzyme-linked immunosorbent assay;telomerase activity；telomeric repeat amplification protocol；TRAP-ELISA

R34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.003

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB911200）

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（郵編832000）；2杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

△通訊作者 E-mail：yanglei62@hznu.edu.cn