澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠腎臟AQP-2表達的影響

景文莉 王長志 范洪亮 張樹峰△

澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠腎臟AQP-2表達的影響

景文莉1王長志2范洪亮1張樹峰1△

目的 探討澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠腎臟水通道蛋白（AQP）-2表達的影響。方法以8％高鹽飼料喂養(yǎng)的方法制備高鹽高血壓動物模型50只，造模成功后隨機分為模型組，西藥組，中藥高、中、低組，各10只；另選10只普通飼料喂養(yǎng)大鼠為正常組。中藥高、中、低組分別給予澤瀉湯加味方混懸液16.2、10.8、5.4 g/(kg·d)；西藥組給予纈沙坦氫氯噻嗪溶液16.65 mg/(kg·d)；模型組及正常組灌服等體積蒸餾水。均按每天1 mL/100 g灌胃，灌胃4周。于給藥1、4、7、14、28 d時測定大鼠收縮壓（SBP），并收集24 h尿量。用免疫組織化學法和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）分別檢測腎臟AQP-2蛋白和mRNA的表達。結果SBP由高到低依次是：模型組＞中藥中組和中藥低組＞西藥組和中藥高組＞正常組，尿量由高到低依次是：西藥組和中藥高組＞中藥中組和中藥低組＞模型組＞正常組，中藥中組與中藥低組間、西藥組與中藥高組間差異無統(tǒng)計學意義。模型組腎臟AQP-2沿集合管內(nèi)壁上皮細胞分布的棕黃色顆粒較正常組及中藥高、中、低組明顯顏色加深而濃厚，分布面積更廣泛。除中藥低組AQP-2 mRNA的表達水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組均低于模型組，高于中藥高組（均P＜0.05）。結論澤瀉湯加味方可通過抑制AQP-2的高表達使血壓降低。

高血壓；腎；水通道蛋白質(zhì)2；大鼠,Wistar；收縮壓；高鹽；尿量；澤瀉湯加味方

高血壓是世界公認的最常見的心血管疾病,是極大危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病機制復雜。腎臟可通過對體內(nèi)細胞外液量的調(diào)節(jié)而發(fā)揮對血壓的調(diào)節(jié)作用，即腎－體液控制。腎－體液控制系統(tǒng)受體內(nèi)諸多因素影響，其中較為重要的是血管升壓素(AVP)和腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）。水通道蛋白-2(AQP-2)是AVP依賴性水通道，現(xiàn)已證明AQP-2是腎臟重吸收水分、濃縮尿液從而調(diào)節(jié)機體水平衡的關鍵蛋白，也是一系列腎臟內(nèi)外涉及水代謝紊亂疾病的分子基礎[1]。本研究旨在探討澤瀉湯加味方能否通過影響高鹽高血壓大鼠腎臟AQP-2的表達來調(diào)節(jié)機體水平衡，從而達到降壓的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性Wistar大鼠100只，平均體質(zhì)量（170±20）g，SPF級，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（津）2009-001。

1.1.2 儀器及試劑 BP-6動物套尾無創(chuàng)血壓儀（成都泰盟科技有限公司），代謝籠、Peltier Thermal Cycler-100（MJ RESEARCH，INC），紫外透射反射分析儀（ZF型，上海嘉鵬科技有限公司）；兔抗大鼠AQP-2多克隆抗體、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）；RNAiso Reagent (Total RNA提取試劑)、TakaRa RNA PCR Kit(AMV)ver.30、DNA Mark Ladder 100 bp[寶生物工程（大連）有限公司）]。

1.1.3 藥物 澤瀉湯加味方：澤瀉21 g、白術9 g、澤蘭15 g、石菖蒲15 g（承德醫(yī)藥集團責任有限公司，批號0712002）；纈沙坦氫氯噻嗪片（諾華制藥有限公司，批號2044768）。

1.2 方法

1.2.1 高鹽高血壓動物模型的制備 參考文獻[1-2]以8％高鹽飼料喂養(yǎng)的方法制備高鹽高血壓動物模型，并根據(jù)預實驗結果對其造模方法加以改造。采用完全隨機法從100只大鼠中抽取10只為正常組（普通飼料喂養(yǎng)），余90只以8％高鹽飼料自然飼養(yǎng)22周，在喂養(yǎng)第18周到22周時進行血壓達標篩選。篩選方法：采用套尾無創(chuàng)血壓儀測量清醒狀態(tài)下大鼠的血壓值，每3 d測量1次，每次連續(xù)測量3遍，收縮壓（SBP）均＞140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）為造模成功[3]。共獲得造模成功大鼠71只。

1.2.2 分組與給藥 采用完全隨機法從71只大鼠中抽取50只，分為模型組、纈沙坦氫氯噻嗪組（西藥組）、中藥澤瀉湯加味方高、中、低劑量組（中藥高、中、低組），每組10只。配制澤瀉湯加味方中藥混懸液，根據(jù)動物實驗方法學，在成人（60～70 kg）和大鼠相同體表面積的條件下，按照人的體質(zhì)量∶大鼠的體質(zhì)量=1∶0.018，中藥高、中、低組分別給藥：16.2、10.8、5.4 g/(kg·d)，其中含生藥量分別為0.81、0.54和0.27 g/mL；西藥組給予纈沙坦氫氯噻嗪溶液16.65 mg/(kg·d)，將片劑研磨，蒸餾水溶解；模型組及正常組灌服等體積蒸餾水。所有實驗大鼠均按1 mL/100 g灌胃，每天灌胃1次，共灌胃4周。除正常組給予普通飼料外，其他組繼續(xù)給予8％高鹽飼料喂養(yǎng)4周。

1.2.3 血壓測量、尿量收集 于給藥后第1、4、7、14、28天用套尾無創(chuàng)血壓儀測定清醒狀態(tài)下大鼠SBP。將大鼠放于代謝籠之內(nèi)禁食、禁水，漏斗下方放量杯，收集24 h尿量。

1.2.4 取材 給藥4周后，10％水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉，迅速摘取大鼠雙腎，然后將1/2腎臟置于10％福爾馬林溶液中固定保存（供免疫組化檢測），余1/2腎臟用消毒鋁箔包好迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存，供逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測。

1.2.5 免疫組織化學SABC法檢測AQP-2蛋白的表達水平 腎組織石蠟切片，脫蠟至水，3％H2O2封閉，微波修復，再封閉，加一抗、二抗、加SABC、DBA顯色、復染、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察并攝片。結果判定：腎臟標本主細胞胞膜和胞漿在光學顯微鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用MIVNT顯微圖像分析系統(tǒng)分析，測定陽性表達細胞的胞膜和胞漿的染色情況，每個樣本計數(shù)10張切片，隨機讀取5個視野，在同等條件下測量AQP-2陽性面積的百分比[4]。

1.2.6 RT-PCR檢測AQP-2 mRNA水平 AQP-2和β-actin引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。用TRIZOL進行組織總RNA提取，對總RNA進行定量；逆轉錄按試劑盒說明進行；擴增條件：先行95℃預變性5 min，行94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。以β-actin作為內(nèi)參照。PCR終產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，UVP成像分析系統(tǒng)拍照觀察結果。采用Quantity One軟件對圖像進行灰度分析，每組實驗至少重復5次。以AQP-2的目的基因條帶與βactin基因條帶的灰度比值作為AQP-2的相對表達水平。

Tab.1 AQP-2 and β-actin primer sequences表1 AQP-2、β-actin引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠血壓的影響 （1）組內(nèi)變化趨勢。除正常組不同時點SBP變化不明顯外，其他組給藥第4天時SBP變化不明顯，后逐漸降低，至給藥第28天時略有升高。（2）組間比較。大鼠SBP由高到低依次是：模型組＞中藥中組和中藥低組＞西藥組和中藥高組＞正常組，中藥中組與中藥低組、西藥組與中藥高組間比較差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of Systolic pressure of rats in each group表2 各組大鼠SBP比較 （n=10，mmHg，±s）

Tab.2 Comparison of Systolic pressure of rats in each group表2 各組大鼠SBP比較 （n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與西藥組比較，d與中藥高組比較，P＜0.05；表2同

組別正常組模型組西藥組中藥高組中藥中組中藥低組F 第1天115.3±2.2 151.4±5.8a122.3±2.0ab128.2±7.3ab138.5±1.1abcd134.4±2.1abcd96.18＊＊第4天113.3±4.8 152.0±4.0a131.0±7.8ab121.6±6.8ab140.6±1.4abcd140.0±1.6abcd79.69＊＊組別正常組模型組西藥組中藥高組中藥中組中藥低組F 第7天115.0±3.4 148.6±5.1a126.6±5.4ab127.3±4.1ab136.3±2.2abcd137.7±1.9abcd87.70＊＊第14天114.7±2.5 142.8±4.0a115.7±8.6ab119.7±3.8ab133.6±1.4abcd132.0±1.3abcd69.05＊＊第28天106.3±2.0 145.3±4.2a117.5±2.5ab122.5±2.0ab130.4±0.8abcd139.9±1.4abcd369.06＊＊

2.2 澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠尿量的影響 （1）組內(nèi)變化趨勢。正常組及模型組不同時點尿量變化不明顯，其他組給藥第4天時尿量增加較明顯，后基本維持在此水平。（2）組間比較。大鼠尿量由高到低依次是：西藥組和中藥高組＞中藥中組和中藥低組＞模型組＞正常組，西藥組與中藥高組、中藥中組與中藥低組間比較差異均無統(tǒng)計學意義,見表3。

2.3 AQP-2免疫組化染色結果比較 AQP-2在腎小球和腎間質(zhì)未見表達，而在腎集合管表達。模型組大鼠腎臟AQP-2沿集合管內(nèi)壁上皮細胞分布的棕黃色顆粒較正常組明顯顏色加深而濃厚，分布面積更廣泛。中藥高、中、低組AQP-2的棕黃色均較模型組明顯色度減輕，面積減少，見圖1。正常組、模型組、西藥組、中藥高組、中藥中組、中藥低組AQP-2陽性面積的百分比分別為0.019±0.007、0.053±0.005、0.024±0.003、0.020±0.009、0.022± 0.006、0.025±0.002。

2.4 各組AQP-2 mRNA的表達水平比較 除中藥低組AQP-2 mRNA的表達水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組均低于模型組；各組AQP-2 mRNA的表達水平均高于中藥高組（均P＜0.05）。見圖2、3。

Tab.3 Comparison of Urine volume of rats in each group表3 各組大鼠尿量比較 （n=10，mL，±s）

Tab.3 Comparison of Urine volume of rats in each group表3 各組大鼠尿量比較 （n=10，mL，±s）

組別正常組模型組西藥組中藥高組中藥中組中藥低組F 第1天12.3±0.5 32.1±1.0a54.5±1.3ab48.5±0.9ab42.6±0.7abcd39.1±1.0abcd2 478.34＊＊第4天13.9±0.9 33.3±2.1a57.0±2.3ab51.8±3.4ab43.8±2.0abcd38.5±0.9abcd523.25＊＊組別正常組模型組西藥組中藥高組中藥中組中藥低組F 第7天13.7±0.8 32.4±0.7a55.3±1.9ab50.2±2.7ab43.9±1.4abcd38.8±0.7abcd912.05＊＊第14天12.8±0.8 32.9±0.6a55.4±1.0ab51.0±2.8ab44.5±2.0abcd38.8±0.6abcd983.28＊＊第28天13.5±0.7 32.6±0.5a57.0±1.5ab52.1±2.0ab43.3±1.8abcd38.5±0.7abcd1 341.75＊＊

Fig.2 AQP-2mRNA expression results in renal tissue of rats in each group圖2 各組大鼠腎組織AQP-2 mRNA的表達結果

Fig.3 AQP-2 mRNA expression in Renal tissue of rats圖3 各組AQP-2 mRNA的表達水平比較

3 討論

有研究認為高血壓患者多存在著水濁內(nèi)蘊、痰濕阻滯、瘀血內(nèi)停的病理因素；且水濁、痰濕、瘀血相互纏綿，共同作用于疾病的發(fā)生、發(fā)展，致使本病纏綿不愈、兼癥叢生。運用或兼用利水泄?jié)帷㈧钐祷瘽?、活血化瘀等在治療高血壓及其并發(fā)癥以及緩解靶器官的損害等方面，均取得了一定的療效[4-6]。

澤瀉湯加味方是根據(jù)中醫(yī)基礎理論及臨床經(jīng)驗總結而成的方劑，其特點是通過多途徑、多靶點的整體調(diào)節(jié)，通過利水為主，利水、活血、祛痰三法合一發(fā)揮降壓作用，具有安全、可靠、不良反應小，可連續(xù)、長期服用的特點，旨在將血壓能夠控制、穩(wěn)定在一定水平，改善中醫(yī)證候及生存質(zhì)量，減少患者對西藥的用量及依賴性。

流行病學調(diào)查結果顯示，人群食鹽攝入量越高，高血壓流行情況越普遍[7]。高血壓時，鈉代謝障礙可涉及多個器官，也可導致神經(jīng)內(nèi)分泌激素的異常分泌，其中AVP是重要的調(diào)節(jié)因素[8]。受AVP調(diào)控且在腎臟中表達的AQP-2是調(diào)節(jié)機體水代謝的關鍵蛋白，腎臟集合管主細胞內(nèi)的AQP-2的表達、穿梭增加是導致水鈉潴留的重要環(huán)節(jié)。

本研究結果顯示，AQP-2在腎臟的集合管表達，而在腎小球和腎間質(zhì)未見表達，與已往報道一致[9]。模型組AQP-2蛋白和mRNA的表達水平均明顯高于正常組。AQP-2有2種調(diào)節(jié)方式[10]，本研究中AQP-2水平變化的機制是由于鈉潴留等一些外周性和中樞性因素致使血漿滲透壓、壓力負荷及容量負荷發(fā)生改變，刺激下丘腦－垂體系統(tǒng)釋放AVP與腎小管的V2受體結合，激活腺苷酸環(huán)化酶，通過穿梭機制使集合管主細胞內(nèi)AQP-2發(fā)生重新分布，導致管腔側膜上活性AQP-2數(shù)目增加；而在AVP長期作用下，AQP-2本身的合成也可明顯增強，表現(xiàn)為其mRNA與蛋白分子表達顯著增強，水重吸收增加，此變化與AVP水平增高成正相關[11]。

中藥組灌服澤瀉湯加味方后，各給藥組的血壓下降，尿量增加。給藥組的AQP-2 mRNA及蛋白水平低于模型組。筆者認為澤瀉湯加味方是通過中藥組方發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，通過多靶點、多途徑發(fā)揮其降壓作用，其中以利尿作用為主，加之活血、祛痰。利水可降低AQP-2的表達，而AQP-2是AVP依賴性水通道,二者間呈正比關系；澤瀉湯加味方可降低AVP分泌，使腎臟對水的重吸收減少，以減少水潴留，從而使血壓恢復到正常水平[12]。

Fig.1 AQP-2 immunohistochemical staining of renal tissue in each group(×40)圖1 各組大鼠腎組織AQP-2免疫組化染色結果（×40）

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（2014-03-06收稿 2014-07-14修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of Modified Zexie Decoction on Renal Aquaporin-2 Expression in Hypertension Rats Induced by High-Salt

JING Wenli1，WANG Changzhi2，F(xiàn)AN Hongliang1，ZHANG Shufeng1△
1 Chengde Medical University，Chengde 067000,China;2 Hebei Union University College of Traditional Chinese Medicine
△

E-mail：zsf@cdmc.edu.cn

ObjectiveTo explore the effect of modified Zexie Decoction on renal aquaporin-2(AQP2)expression in high-salt hypertensive rat.MethodsHypertensive rats model was established by feeding rat with 8％high salt.Rats(n= 50)were divided into model group,modern medicine group,traditional Chinese medicine groups of high,medium,low dose, with 10 rats in each group.The other 10 rats were fed with ordinary diet as normal group.Rats in traditional Chinese medicine of high,medium,low groups were given Zexie Decoction suspension of 16.2,10.8 and 5.4 g/(kg·d)respectively;Rats in modern medicine group was given Valsartan hydrochlorothiazide 16.65 mg/(kg·d);the model group and normal group was administered with equal volume of distilled water.Animals were feed with medications at 1 mL/100 g by gavage for 4 weeks. On the 1st,4th,7th,14thand,28thday of administration,we measured SBP and collected 24 h urine.We employed immunohistochemistry to detect renal AQP-2 protein expression level and RT-PCR to detect renal AQP-2 mRNA transcription level.ResultsThe rank of SBP from high to low is:model group＞traditional Chinese medicine medium and low dose groups＞traditional Chinese medicine high dose group and western medicine group＞normal group.The rank of urine volume from high to low is:Western medicine group and traditional Chinese medicine high dose group＞traditional Chinese medicine medium and low dose group＞normal group,the difference was not statistically significant between traditional Chinese medicine medium and low dose group,or between western medicine group and traditional Chinese medicine high dose group. The renal AQP-2 in epithelial cells along the collecting duct wall of rats in model group show brown particles which are darker and wider distributed than those in normal group and traditional Chinese medicine of high,medium,low dose groups. RT-PCR results show that AQP-2 mRNA expression is highest in rats of model group and lowest in rats of traditional Chinese medicine high dose group(P＜0.05).No statistical significance of AQP mRNA level was found between traditional Chinese medicine low group and model group(P＜0.05).ConclusionModified Zexie Decoction can lower blood pressure by inhibiting the expression of AQP-2.

hypertension;kidney;aquaporin 2;rats,Wistar;SBP;high salt;urine volume;modified zexie decoction

R544.1，R285

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.012

河北省科學技術支撐項目計劃課題(NO.09276101D-20)

1承德醫(yī)學院（郵編067000）；2河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院△

E-mail：zsf@cdmc.edu.cn