β2-GP1、VEGF、TF與大鼠DVT形成的關系

宋 恩 李光第 婁振凱 王 揚 趙學凌

β2-GP1、VEGF、TF與大鼠DVT形成的關系

宋 恩 李光第 婁振凱 王 揚 趙學凌△

目的 建立大鼠下腔靜脈狹窄法深靜脈血栓（DVT）模型，檢測大鼠血液中β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管內皮生長因子（VEGF）、組織因子（TF）表達變化，研究其與DVT形成的關系。方法70只SD大鼠，隨機分為對照組（10只），假手術組（30只），模型組（30只），模型組于造模后2 h、8 h、24 h分為3個亞組，采集各組大鼠下腔靜脈血5 mL，ELISA法檢測β2-GP1、VEGF、TF水平。結果大鼠血液中β2-GP1、VEGF、TF表達在對照組與假手術組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），造模后2～24 h，β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表達呈上升趨勢，24 h時達峰值，高于對照組、假手術組、造模后2 h組和造模后8 h組（P＜0.01），其余4組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論大鼠DVT形成過程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促進血栓形成的作用。

β2糖蛋白Ⅰ；血管內皮生長因子類；凝血致活酶；靜脈血栓形成；大鼠，Sprague-Dawley

深靜脈血栓(deep vein thrombosis，DVT)是指血液在深靜脈血管腔內異常凝結，導致血管管腔阻塞，靜脈血回流受阻，繼發(fā)一系列相應的臨床癥狀[1]。下肢深靜脈血栓形后，栓子可脫落，并隨血流堵塞肺動脈，造成致命性肺栓塞(pulmonary embolism，PE)[2]。目前DVT研究主要集中在分子機制的探索，本實驗建立DVT大鼠模型，檢測并分析β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管內皮生長因子（VEGF）、組織因子（TF）在大鼠血液中的表達變化，初步探討其與DVT形成的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠β2-GP1、VEGF、TF的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自Ebioscience公司；微量取樣器購自Eppendorf公司，冷凍離心機購于Thermo公司，酶標儀購于Bio-Tek公司；各種規(guī)格的離心管、槍尖、PCR管購于Axygen公司。二甲苯、無水乙醇、冰乙酸、95％乙醇、蘇木素、伊紅購于天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 大鼠DVT模型建立及分組 70只SPF級SD大鼠，購自昆明醫(yī)科大學醫(yī)學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCKK（滇）2005-0008，雌性，體質量（180±40）g。光線、通風良好，自由飲水、進食。所有動物相關實驗都經(jīng)昆明醫(yī)科大學動物實驗和倫理委員會批準。動物實驗隨機分為對照組10只，假手術組30只，模型組30只，模型組隨機分為造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h組，每組10只。對照組：SD大鼠不做任何處理，正常喂養(yǎng)。假手術組：大鼠腹腔內注射5％水合氯醛6 mL/kg麻醉，0.5％碘伏消毒、鋪巾，在劍突下1 cm處，沿腹中線取1.5 cm切口，逐層切開大鼠皮膚、皮下肌層、腹膜，將腹腔內容物剝離出腹腔外，暴露及分離下腔靜脈，還納腹腔內容物，逐層關腹，保溫，正常喂養(yǎng)。模型組：大鼠麻醉、消毒、鋪巾，切開腹腔、暴露同假手術組，此時可見暴露的下腔靜脈，于左腎靜脈與下腔靜脈交匯處下方，分離下腔靜脈后，用5-0愛惜康縫合線沿下腔靜脈走形放置，再用4-0愛惜康縫合線結扎此處下腔靜脈，再抽去5-0愛惜康縫合線，分離出交匯于下腔靜脈在髂靜脈上方的2條側支分支靜脈并用5-0愛惜康縫合線結扎，見圖1。還納腹腔內容物逐層關腹縫合，保溫，正常喂養(yǎng)。

Fig.1 Rat inferior vena cava partial stasis(narrow)DVT model圖1 大鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型

1.3 實驗大鼠樣本取材、處理 假手術組及模型組的造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h組按不同時點（造模后2 h、8 h、24 h）打開腹腔后觀察造模段下腔靜脈腫脹度、顏色、局部組織反應程度。從大鼠下腔靜脈結扎處上方（腎靜脈以上）獲取靜脈血液樣本5 mL，離心機3 000 r/min離心15 min，分離有核細胞與血漿，分裝后，分別置于-80℃深低溫冷凍冰箱備用。同時，取距結扎線1.0 cm的下腔靜脈及血栓栓體，置于4％多聚甲醛固定后送石蠟切片，HE染色觀察血栓形成狀態(tài)。

1.4 ELISA檢測大鼠血中β2-GP1、VEGF、TF表達 ELISA檢測步驟嚴格按Ebioscience試劑盒說明書標準操作進行，按照ELISA說明書稀釋標準蛋白濃度，順序添加反應物，在反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD）值，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線來換算出待測樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件，對所有測量的數(shù)值進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較采用Tukey HSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況、肉眼觀察及病理學檢測結果 假手術組大鼠因麻醉原因死亡1只，造模后8 h、 24 h組大鼠各死亡1只，原因為術后傷口滲血過多，其余實驗大鼠正常。對照組：肉眼觀察，下腔靜脈通暢，透過管壁可見管腔內暗紅色流動血液，腹腔內未見有靜脈血管擴張。取材血管管徑粗細均勻，管壁薄而柔軟，富有彈性，內膜面呈乳白色，平整、光滑。鏡下觀察：整個血管內膜表面平整，內皮細胞大小均勻、排列整齊，管腔中無血栓形成。假手術組：下腔靜脈結扎后，在結扎處下方的下腔靜脈立即膨脹，解除結扎線后，膨脹消失，下腔靜脈直徑未見明顯變化，血管管徑粗細均勻，下腔靜脈通暢，可見血管內有暗紅色血液流動，血管富有彈性。鏡下觀察：整個血管內膜表面平整，內皮細胞大小均勻、排列整齊,管腔中無血栓形成，見圖2。模型組：下腔靜脈結扎后，在結扎處下方的下腔靜脈立即膨脹，血管顏色變暗，血管彈性可；造模后2 h見結扎處下方的下腔靜脈血管內有黑色凝塊樣物質形成，壓迫血管，凝塊樣物質可移動，鏡下觀察見不完全血栓形成，同時可見少量炎性細胞侵潤，血栓大部分為纖維素和中性粒細胞；造模后8 h，下腔靜脈顏色變黑，彈性下降，血管內出現(xiàn)白色和黑色混合樣凝塊樣物質，鏡下觀察見完全血栓形成，血栓充滿整個管腔，靜脈壁內皮細胞剝脫，下層裸露，炎性細胞浸潤加重，血栓與內皮細胞無粘連；造模后24 h，下腔靜脈直徑繼續(xù)增大達到峰值，鏡下觀察見血栓充滿整個管腔，同時與大部分靜脈壁粘連緊密，出現(xiàn)機化現(xiàn)象，炎性細胞浸潤進一步加重，見圖3。

Fig.2 Venous tissue(HE,×40)in normal control group(left)and sham operation group(right)圖2 對照組（左）、假手術組（右）靜脈壁組織(HE，×40)

2.2 大鼠血漿中β2-GP1、VEGF、TF表達 造模后2～24 h,血液中的β2-GP1、VEGF、TF表達逐漸增加。造模后24 h達峰值，較對照組、假手術組及造模后2 h、8 h組均增高，差異有統(tǒng)計學意義，β2-GP1、VEGF、TF在其余4組間比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Fig.3 Venous tissue of rat IVC narrow DVT model at the 2ndhour,the 8thhour and the 24thhour after operation(HE,×40)and venous thrombus圖3 大鼠下腔靜脈狹窄法術后2 h、8 h、24 h靜脈壁組織切片染色（HE，×40）及靜脈血栓形成

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3組TF、VEGF和β2-GP1表達水平比較 （±s）

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3組TF、VEGF和β2-GP1表達水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01;a與造模后24 h組比較，P＜0.01

組別正常對照組假手術組造模后2 h組造模后8 h組造模后24 h組F n 10 29 10 99 TF（ng/L）150.965±25.511a168.237±30.170a181.162±32.844a203.051±44.481a326.781±84.550 27.015＊＊VEGF（ng/L）190.810±76.009a206.523±78.865a225.726±67.380a258.827±53.851a370.979±147.822 7.178＊＊β2-GP1（μg/L）2 934.840±395.284a3 150.027±509.658a3 180.955±552.821a3 356.866±460.596a4 456.005±417.372 15.093＊＊

3 討論

DVT是靜脈回流障礙性疾病，其臨床主要表現(xiàn)為肢體腫脹、疼痛、皮溫改變和功能障礙，主要好發(fā)于下肢，常見于骨科大手術后。DVT形成后的血栓脫落是引起肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）栓子的主要來源，PTE是DVT的嚴重并發(fā)癥同時也是PE的主要類型。PE在西方已經(jīng)成為繼缺血性心臟性疾病和腦卒中后的又一大常見致死因素，其病死率高達15％～20％，因此對DVT的診斷和治療應給予高度的重視。早期預防和積極治療可以將病死率降低到5.8％[3]。DVT的形成機制較為復雜，Virchow于1856年提出的內皮細胞損傷、血流動力學改變、血液高凝狀態(tài)是導致血栓形成的三大因素理論[4]，這一理論長期以來得到普遍公認，但是隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展和研究不斷的深入，尤其是分子生物學、基因工程技術飛速發(fā)展，在對Vrichow的理論完善的同時也對其提出了質疑，如大部分的DVT患者血管壁無明確損傷[5]。目前DVT被公認為是一個多系統(tǒng)、多因素，形成過程復雜的疾病，參與其中的包括血管內皮細胞、血小板、凝血與抗凝血系統(tǒng)、纖溶與抗纖系統(tǒng)、炎癥反應、血液流變學及血液動力學等共同作用的結果，其調控網(wǎng)絡極為復雜多變，是一個動態(tài)變化的過程。因此，著手于分子、基因和蛋白水平來研究DVT的發(fā)生、發(fā)展及消退過程，對深入研究DVT的形成就顯得極為重要[6]。

β2-GP1在血漿中以環(huán)狀和鏈狀兩種構象存在，在生理情況下循環(huán)血液中的β2-GP1是以環(huán)狀結構存在的，當環(huán)狀的β2-GP1被負性磷脂捕獲后，環(huán)狀結構展開形成鏈狀結構的β2-GP1，暴露I區(qū)抗原表位。1個抗β2-GP1抗體可以同時與2個β2-GP1結合，形成二聚化的β2-GP1，從而引發(fā)了β2-GP1抗體/β2-GP1與細胞的結合進而影響細胞的生物功能[7]。關于β2-GP1，目前研究主要集中在自身免疫系統(tǒng)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、抗磷脂抗體綜合征。近年來研究發(fā)現(xiàn)β2-GP1抗體陽性患者即使無免疫系統(tǒng)疾病，也可發(fā)生動靜脈血栓，特別地代謝綜合征患者，進一步研究表明，在SLE患者中β2-GP1抗體加速血小板凝集，并作用于內皮細胞，與磷脂質等結合導致不同抗體的形成，發(fā)生抗磷脂抗體綜合征，從而導致血栓等發(fā)生[8]。VEGF是由2 個17～22 ku亞基構成的糖蛋白，在缺血、缺氧等應激狀態(tài)下，均可引起VEGF水平的增高。VEGF具有促進細胞內細胞Ca2+聚集的作用、增加血管的通透性、促進血管生成及動員內皮祖細胞等生物學功能。VEGF是一種對血管生長有強力誘導并特異性作用于血管內皮細胞的生長因子，是促進血管生長的關鍵因子[9]。Olszewska-Pazdrak等[10]發(fā)現(xiàn)在人體中，慢性缺氧可導致內皮細胞損傷，引起VEGF表達下降，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAKP）途徑，可引起內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及一氧化氮（NO）的分泌減少，減少新生血管的生成。Durán等[11]發(fā)現(xiàn)，VEGF可以通過蛋白激酶B（PKB/AKT）等途徑，誘導eNOS的產(chǎn)生，調控NO生成，影響血管內皮細胞的通透性及穩(wěn)定性，減少血管內皮細胞的損傷。Lu 等[12]發(fā)現(xiàn)接頭蛋白（Gab1）因子通過蛋白激酶A （PKA）與eNOS途徑，來調節(jié)血管再生，從而能調節(jié)產(chǎn)后缺血和VEGF的表達。在外源性凝血途徑中，TF作為該凝血途徑的啟動子發(fā)揮不可或缺的作用。通常TF主要以兩種形式存在：一種是作為跨膜蛋白，當血管壁受損，內皮下組織暴露到循環(huán)血液中時TF被激活；另一種以可溶解的裂解形式存在。當血管壁受損發(fā)生炎性反應時，機體就會產(chǎn)生大量炎性細胞和炎性因子[13]。所以血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展與TF的異常表達有著密切的關聯(lián)。相關研究發(fā)現(xiàn)抗血小板聚集藥物阿卡地新（Acadesine）可通過激活PI3K-AKT信號通路來抑制TF在內皮細胞及單核巨噬細胞中的表達[14]。

本研究在動物實驗中，建立大鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型，檢測大鼠造模后不同時點（2 h、8 h、24 h）β2-GP1、VEGF、TF的表達，發(fā)現(xiàn)對照組與假手術組血液中β2-GP1、VEGF、TF無明顯差異，造模后2～24 h,β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表達逐漸上升，24 h時達峰值。提示在DVT形成過程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促進血栓形成的作用。

DVT是一個多因素多系統(tǒng)的復雜疾病，目前研究熱點集中在內皮細胞損傷、內皮細胞損傷介導的血小板活化、炎癥因子激活等一系列關鍵、緊密聯(lián)系的環(huán)節(jié)上，本研究發(fā)現(xiàn)的，β2-GP1、VEGF、TF在DVT形成過程中，可能起到關鍵作用。為進一步在細胞層面研究、闡明其機制打下重要基礎。

[1]Tenna AM,Kappadath S,Stansby G.Diagnostic tests and strategies in venous thromboembolism[J].Phlebology,2012,27(2):43-52.doi:10.1258/phleb.2012.012S35.

[2]Vazquez SR,Kahn SR.Advances in the diagnosis and management of postthrombotic syndrome[J].Best Pract Res Clin Haematol,2012, 25(3):391-402.doi:10.1016/j.beha.2012.06.006.

[3]Ashrani AA,Silverstein MD,Lahr BD,et al.Risk factors and underlying mechanisms for venous stasis syndrome:a population-based case-control study[J].Vascular Medicine,2009,14(4):339-349. doi:10.1177/1358863X09104222.

[4]Kumar DR,Hanlin E,Glurich I,et al.Virchow’s contribution to the understanding of thrombosis and cellular biology[J].Clin Med Res, 2010,8(3-4):168-172.doi:10.3121/cmr.2009.866.

[5]Kyrle PA,Eichinger S.Is virchow’s triad complete[J]?Blood, 2009,114(6):1138-1139.doi:10.1182/blood-2009-05-223511.

[6]Mackman N.Triggers,targets and treatments for thrombosis[J].Nature,2008,451(7181):914-918.doi:10.1038/nature06797.

[7]Persijn L,Decavele AS,Schouwers S,et al.Evaluation of a new set of automated chemiluminescense assays for anticardiolipin and anti-beta2-glycoprotein I antibodies in the laboratory diagnosis of the antiphospholipid syndrome[J].Thromb Res,2011,128(6):565-569.doi:10.1016/j.thromres.2011.04.004.

[8]Mineo C,Shaul PW.New insights into the molecular basis of the antiphospholipid syndrome[J].Drug Discov Today Dis Mech,2011,8 (1):47-52.doi:10.1016/j.ddmec.2011.12.002.

[9]Waltham M,Evans CE,Humphries J,et al.Protein fragments from the VEGF binding domain of fibronectin are expressed in distinct spatial and temporal patterns during venous thrombus resolution[J]. Thromb Res, 2012, 130(2):281- 284. doi: 10.1016/j. thromres.2012.05.006.

[10]Olszewska-Pazdrak BL,Hein TW,Olszewska P,et al.Chronic hypoxia attenuates VEGF signaling and angiogenic responses by downregulation of KDR in human endothelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2009, 296(5):C1162- 1170. doi: 10.1152/ajpcell.00533.2008.

[11]Durán WN,Breslin JW,Sánchez FA.The NO cascade,eNOS location,and microvascular permeability.[J]Cardiovasc Res,2010,87(2): 254-261.doi:10.1093/cvr/cvq139.

[12]Lu Y,Xiong Y,Huo Y,et al.Grb-2-associated binder 1(Gab1)regulates postnatal ischemic and VEGF-induced angiogenesis through the protein kinase A-endothelial NOS pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(7):2957-2962.doi:10.1073/pnas.100939 5108.

[13]Sovershaev MA,Egorina EM,Osterud B.Evidence for direct transfer of tissue factor from monocytes to platelets in whole blood[J]. Blood Coagul Fibrinolysis,2012,23(4):345-350.doi:10.1097/ MBC.0b013e328350bf2f.

[14]Zhang W,Wang J,Wang H,et al.Acadesine inhibits tissue factor induction and thrombus formation by activating the phosphoinositide 3-kinase/Akt signaling pathway[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010,30(5):1000-1006.doi:10.1161/ATVBAHA.110.203141.

（2014-08-22收稿 2014-08-30修回）

（本文編輯 魏杰）

The Correlation between β2-GP1，VEGF and TF with Rat DVT Formation

SONG En,LI Guangdi,LOU Zhenkai,WANG Yang,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the 1stAffiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China
△

E-mail：zxidoctor@hotmail.com

ObjectiveTo build rat DVT inferior vena cava partial stasis(narrow)model,to detected the expression of β2-GP1,VEGF and TF in rat blood,and to investigat the correlation between β2-GP1,VEGF and TF with DVT.Methods SD rats(n=70)are divided into control group(n=10),sham operation group(n=30)and the model group(n=30)randomly and DVT model was built by the inferior vena cava partial stasis(narrow)after 2 h,8 h and 24 h respectively.In each time point,ten rats were taken in each group,inferior vena cava blood were collected while β2-GP1,VEGF and TF expression were detected by ELISA.ResultsIn rat experiment,compared with control group,there was no significant change inexpression of β2-GP1,VEGF and TF in sham operation group(P＞0.05).Levels of β2-GP1,VEGF and TF were increased at the 2ndhour and 8thhour then peak at the 24thhour which was higher than those in the 24thhour control group and in Sham group and it was also higher than those in the 2ndhour and the 8thhour in model group with statistical significant difference(P＜0.01).ConclusionBased on the above experimental data,in rat DVT formation process,β2-GP1, VEGF and TF may play an important role in promote DVT formation.

beta2-glycoproteinⅠ;vascular endothelial growth factors;thromboplastin;venous thrombosis;rats, Sprague-Dawley

R654.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.007

國家自然科學基金資助項目（81060151）；云南省衛(wèi)生科技計劃項目（2012ws0007）；云南省科技廳重點新產(chǎn)品開發(fā)計劃項目（2010BC010）

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科（郵編650032）

△通訊作者 E-mail:zxidoctor@hotmail.com