順鉑對結直腸癌細胞增殖及侵襲能力的影響

徐陽

順鉑對結直腸癌細胞增殖及侵襲能力的影響

徐陽

目的探討順鉑對人結直腸癌細胞SW480增殖及侵襲力的影響。方法以SW480細胞為研究對象，設定未經(jīng)處理的SW480細胞為對照組，給予不同濃度順鉑進行不同時間干預，應用MTT法、Transwell侵襲小室、定磷法檢測SW480細胞的增殖、侵襲力及Na+-K+-ATP酶活性。結果生理濃度順鉑（70 μmol/L）在48 h即可抑制SW480細胞的增殖，與72和96 h相比抑制率差異無統(tǒng)計學意義；70 μmol/L順鉑處理48 h時，即可降低穿越Matrigel膜基質的細胞數(shù)；分別采用17.5、35、70和140μmol/L4個梯度濃度的順鉑作用于SW480細胞48 h后，35、70和140μmol/L組細胞中Na+-K+-ATP酶活性均顯著升高，且順鉑濃度達70μmol/L時Na+-K+-ATP酶即可達到較高活性。結論Na+-K+-ATP酶活性的降低可能導致對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力調節(jié)作用減弱，可能與結直腸癌細胞SW480耐順鉑有關。

結直腸腫瘤；順鉑；細胞增殖；腫瘤侵潤；抗藥性,腫瘤；SW480；Na+-K+-ATP酶

結直腸癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]。腫瘤的轉移是一個涉及多因素和多步驟調控的過程，而通過侵襲穿過基底膜則是轉移發(fā)生的開始[2]。據(jù)報道，結直腸癌病死數(shù)約占2012年美國癌癥總死亡數(shù)的9％[3]。順鉑是目前治療實體瘤的一線藥物，臨床應用廣泛，然而其耐藥性成為應用的瓶頸[4]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞胞內順鉑蓄積的減少是其對順鉑產生耐藥性的機制之一，而結直腸癌常伴有Na+-K+-ATP酶活性下降及其亞單位異常表達[5]，但其是否和順鉑耐藥有關尚不明確。本研究旨在探討順鉑對SW480細胞增殖和侵襲作用的影響及Na+-K+-ATP酶活性和表達的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人結直腸癌細胞SW480購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司；噻唑藍（MTT）購自美國AMRESCO公司；Transwell小室（8 μm）購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司；Na+-K+-ATP酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測細胞的增殖將SW480細胞均按3×103/孔，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞的融合度為70％～80％時，分別加入含70 μmol/L順鉑的培養(yǎng)基孵育24、48、72及96 h，每時點重復6孔；同時設不加順鉑的對照組，各組每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，酶標儀上檢測570 nm的光密度（OD）值，并計算抑制率。抑制率=（對照組OD值－處理組OD值）/對照組OD值×100％。以上試驗重復3次并取平均值。

1.2.2 細胞侵襲能力的檢測取100 μL稀釋液加入Transwell上室中，并在小室底部均勻涂抹一層稀釋的Matrigel膜基質，放入細胞培養(yǎng)箱中30 min，將Transwell小室倒置。取100 μL細胞懸液加在底面上，放入細胞培養(yǎng)箱中12 h，然后將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，上室加入培養(yǎng)基，下室加入牛血清白蛋白（BSA）培養(yǎng)基，再放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。試驗設濃度分別為17.5、35、70、140μmol/L的順鉑處理SW480細胞48 h，同時設不加順鉑的對照組。于下室中的BSA培養(yǎng)基中加入含有以上不同濃度的順鉑500 μL。取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦拭小室底面除去未穿過細胞，用PBS浸洗2次，每個Transwell上室均加入Wright-Giemsa A液放置10 min后，再加入Wright-Giemsa B液染色10 min，用MiliQ水除去染料。在倒置顯微鏡下隨機讀取5個視野，計算每視野內的細胞數(shù)，實驗重復3次取平均值。

1.2.3Na+-K+-ATP酶活性測定在細胞培養(yǎng)瓶中接種細胞，分別加入17.5、35、70、140μmol/L的順鉑培養(yǎng)48 h，收集細胞，超聲破碎，測定蛋白總量。采用定磷法測定Na+-K+-ATP酶活性，其測定原理為ATP酶可以分解ATP生成ADP和無機磷，而根據(jù)測定反應后1 h無機磷[μmol（/h·mg）]的量即可判斷出Na+-K+-ATP酶活力的高低。實驗操作嚴格按試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。結果以均數(shù)±標準差（±s）形式表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 順鉑對SW480細胞增殖活力的影響生理濃度的順鉑（70μmol/L）在24、48、72和96 h時間均能顯著抑制SW480細胞的增殖，48 h時即可達到較高的抑制細胞增殖活力，且抑制效果不隨作用時間的延長而增加，見表1。

Tab.1 Effects of Cisplatin on the proliferation of SW480 cells at different time points表1 不同時間順鉑對SW480細胞增殖抑制率的影響（％，±s）

Tab.1 Effects of Cisplatin on the proliferation of SW480 cells at different time points表1 不同時間順鉑對SW480細胞增殖抑制率的影響（％，±s）

＊P＜0.05；a與（1）組比較，P＜0.05

組別70μmol/L 24 h組（1）70μmol/L 48 h組（2）70μmol/L 72 h組（3）70μmol/L 96 h組（4）F n3333抑制率33.65±2.85 42.85±3.27a35.28±3.78 37.63±4.25 5.553＊

2.2 順鉑對SW480細胞侵襲力的影響70和140 μmol/L順鉑作用SW480細胞48 h，穿越Matrigel膜基質的細胞數(shù)較17.5和35μmol/L組下降，表明低濃度順鉑對SW480的侵襲能力影響不大，而高濃度能夠降低SW480細胞的侵襲能力，見表2。

Tab.2 Effects of different concentrations of Cisplatin on migrating of SW480 cells表2 不同濃度順鉑對SW480細胞侵襲力的影響（±s）

Tab.2 Effects of different concentrations of Cisplatin on migrating of SW480 cells表2 不同濃度順鉑對SW480細胞侵襲力的影響（±s）

＊P＜0.05；a與（1）組比，b與（2）組比，c與（3）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）17.5μmol/L48 h組（2）35μmol/L48 h組（3）70μmol/L48 h組（4）140μmol/L48 h組（5）F n66666細胞數(shù)48.16±4.58 40.64±4.37a36.23±3.67a27.18±3.30abc24.62±3.04abc4.456＊

2.3Na+-K+-ATP酶活性檢測17.5～140μmol/L 4個梯度濃度的順鉑作用于SW480細胞48 h后，35、 70和140μmol/L組細胞中Na+-K+-ATP酶活性均顯著升高，且順鉑濃度達70μmol/L時Na+-K+-ATP酶即可達到較高活性，見表3。

Tab.3 Effects of different concentrations of Cisplatin on Na+-K+-ATPase activity of SW480 cells表3 不同濃度的順鉑對SW480細胞中Na+-K+-ATP酶活性的影響[μmol（/h·mg），±s]

Tab.3 Effects of different concentrations of Cisplatin on Na+-K+-ATPase activity of SW480 cells表3 不同濃度的順鉑對SW480細胞中Na+-K+-ATP酶活性的影響[μmol（/h·mg），±s]

＊P＜0.05；a與（1）組比，b與（2）組比，c與（3）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）17.5μmol/L48 h組（2）35μmol/L48 h組（3）70μmol/L48 h組（4）140μmol/L48 h組（5）F n33333 Na+-K+-ATP酶活性8.38±0.41 9.36±0.62 10.27±0.54a11.35±0.48abc11.76±0.43abc5.553＊

3 討論

3.1Na+-K+-ATP酶與順鉑的作用機制如何減少順鉑耐藥的發(fā)生，增強化療藥物的敏感性是醫(yī)學研究的重點領域[6]。細胞膜上Na+-K+-ATP酶是由多種功能相關的多肽鏈所組成的蛋白多聚體，可催化Na+、K+跨膜轉運，在哺乳動物均有發(fā)現(xiàn)。Na+-K+-ATP酶參與細胞的多種基本生理活動，研究證實Na+-K+-ATP酶首先產生電化學梯度，然后調節(jié)順鉑進入多種細胞[7-8]。有學者發(fā)現(xiàn)在順鉑作為人舌癌細胞（HSC-3）、人口腔鱗癌細胞（BHY）中Na+-K+-ATP酶特異性抑制劑，可以顯著減少其在細胞內的蓄積，并且耐順鉑細胞系BHY細胞的Na+-K+-ATP酶活性顯著低于順鉑敏感系HSC-3細胞，證明順鉑在細胞內的蓄積可能與Na+-K+-ATP酶及其活性有關[9]。目前的研究發(fā)現(xiàn)Na+-K+-ATP酶有許多亞基，其中α亞基主要起催化作用，是其主要功能亞基和活性中心；β亞基主要起調節(jié)作用，對維持Na+-K+-ATP酶活性起著重要作用[10]。近年研究表明，Na+-K+-ATP酶活性的改變和基因的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著十分密切的聯(lián)系，α和β亞基的表達水平對預測某些腫瘤的預后有著重要意義[11]。

3.2Na+-K+-ATP酶活性與順鉑的關系本研究表明生理濃度的順鉑（70 μmol/L）在24、48、72和96 h時均能顯著抑制SW480細胞的增殖，48 h時抑制率最高；低濃度順鉑對SW480的侵襲能力影響不大，而高濃度能夠降低SW480細胞的侵襲能力。已有實驗證明Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基和順鉑進入腫瘤細胞內的過程有關，并且這兩種亞基的高表達和順鉑敏感性有關[12]。推測順鉑可能通過影響其某一亞基的表達而影響酶的活性，進而影響了順鉑進入細胞內這一過程，從而表現(xiàn)出順鉑敏感性的變化。這有待進一步采用RT-PCR方法研究證實。

綜上所述，Na+-K+-ATP酶活性的降低可能導致對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力調節(jié)作用減弱，可能與結直腸癌細胞SW480耐順鉑有關，檢測其活性對結直腸癌的診斷和預后具有重要價值。

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（2013-10-30收稿2014-03-20修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of Cisplatin on Proliferation and Invasion of Colorectal Cancer Cells

XU Yang
Department of Colorectal Surgery,The Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin on proliferation and invasion of colorectal cancer cell line SW480.MethodsSW480 cells were used as the research object,and untreated SW480 cells were used as the control group.Different concentrations of cisplatin was given at different times to intervene.The MTT,Transwell chamber and phosphate determination methods were used to detect proliferation,invasion and Na+-K+-ATPase activity expression level in SW480 cells.ResultsThe physiological concentration of cisplatin(70μmol/L)inhibited the proliferation of SW480 cells at 48 h.There was no significant difference in the inhibition rate at 48 h compared with 72 h and 96 h.Treatment with 70 μmol/L cisplatin for 48 h reduced the number of cells through Matrigel membrane matrix.The Na+-K+-ATPase activity was significantly increased in 35,70 and 140μmol/L cells after treatment with 17.5,35,70 and 140μmol/L of cisplatin in SW480 cells for 48 h,and Na+-K+-ATPase reached the highest level at 70μmol/L of cisplatin.ConclusionThe decreased activity of Na+-K+-ATPase may lead to the attenuation in proliferation and invasion of colorectal cancer cells,which may be associated with cisplatin resistance in colorectal cancer cell SW480.

colorectal neoplasms；cisplatin；cell proliferation；neoplasm invasiveness；drug resistance,neoplasm；SW480；Na+-K+-ATPase

R349.5，R735.34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.004

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院肛腸外科（郵編300211）