亞甲基藍(lán)測定微量肝素鈉的研究

亓培培

（淮北市環(huán)保局 環(huán)境檢測站，安徽 淮北 235000）

肝素（Hep）為葡糖胺聚糖，是蛋白多糖的一種.在人體內(nèi)由肥大細(xì)胞分泌而自然存在于血液中，在體內(nèi)外均有延緩或阻止血液凝固的作用［1］.作為經(jīng)典的抗凝血藥物，肝素在臨床上的應(yīng)用已達(dá)60年之久，目前仍是心血管和血栓病人的首選抗凝血藥［2］.

肝素是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸組成的，具有不同鏈長的多糖鏈混合物.在水溶液中由于其酸性基團(tuán)的離解而成為帶多個負(fù)電荷的大陰離子.肝素的檢測方法有多種，總的分屬于生物方法［3］和化學(xué)方法兩大類.生物方法是法定方法，因受生物個體的影響較大，不易掌握.化學(xué)方法有分光光度法［4-8］、HPLC法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］、電化學(xué)傳感器［11］等.其中分光光度法因具有操作簡便、快速、儀器價廉、靈敏度較高的優(yōu)點而得到廣泛的應(yīng)用.因此進(jìn)一步研究靈敏度高、選擇性好的新分光光度法有重要的意義.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH為1.4～5.8的緩沖溶液中肝素鈉能與亞甲基藍(lán)發(fā)生締合，使溶液出現(xiàn)明顯的褪色，溶液吸光度的減少與肝素鈉濃度成正比，建立了測定肝素鈉濃度的分光光度法.該方法穩(wěn)定性好，而且反應(yīng)的pH值范圍寬.用于注射用肝素鈉濃度的測定結(jié)果滿意.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；pHs-3型酸度計（上海第二分析儀器廠）.

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1.000 g肝素鈉固體（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），用去離子水溶解稀釋，定容于1 000 mL容量瓶中，其質(zhì)量濃度為1.00 mg/ mL，備用.再準(zhǔn)確量取5.00 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水稀釋，定容于1 000 mL 容量瓶中，制得5.00 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.亞甲基藍(lán)溶液：濃度為5.0×10-4mol/L作為儲備液，再稀釋成2.0×10-5mol/L使用.

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取2.736 g乙酸鈉，量取3 mL 36.5%的乙酸溶液用去離子水稀釋定容于100 mL容量瓶中，備用.根據(jù)體積比配成pH 4.6的緩沖溶液或用酸度計調(diào)制成pH 4.6的緩沖溶液.

上述所需試劑均為分析純或優(yōu)級純，配制溶液用去離子水.

1.2 實驗方法

在25 mL的比色管中依次加入pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液2.0 mL，亞甲基藍(lán)溶液1.0 mL和肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 mL，稀釋至刻度，搖勻，放置10 min 后，以水為參比，測定664 nm 處樣品溶液吸光度A；同時做試劑空白，吸光度值為A0，并計算吸光度差值ΔA=A0-A.

2 結(jié)果和討論

2.1 吸收光譜

分別對未加肝素鈉的1.0 mL 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液和加入20 μg、40 μg、60 μg、80 μg 肝素鈉的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～800 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描所得的吸收光譜如圖1所示.亞甲基藍(lán)溶液在664 nm處的吸收峰出現(xiàn)最大值，加入肝素鈉后，肝素鈉與亞甲基藍(lán)作用使溶液褪色，不加肝素鈉和加入肝素鈉所測得的吸光度之差ΔA在一定范圍內(nèi)與肝素鈉含量呈線性關(guān)系.

圖1 吸收光譜（1-5肝鈉素濃度）

2.2 緩沖溶液pH對體系的影響

按實驗方法改變緩沖溶液的pH 進(jìn)行實驗，結(jié)果見表1.由表1可知，在緩沖溶液的pH維持在4.6時肝素鈉和亞甲基藍(lán)的吸收強(qiáng)度下降顯著，所以本實驗選用pH為4.6的緩沖溶液.

表1 緩沖溶液pH對體系的影響

2.3 緩沖溶液用量對體系的影響

按實驗方法改變緩沖溶液的用量進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，在緩沖溶液用量為2.0 mL時肝素鈉和亞甲基藍(lán)的吸收強(qiáng)度下降顯著，所以本實驗選用pH值為4.6的緩沖溶液最佳用量為2.0 mL.

圖2 緩沖溶液的用量/（V/mL）

圖3 亞甲基藍(lán)的用量/（V/mL）

2.4 亞甲基蘭用量對體系的影響

按實驗方法改變亞甲基藍(lán)的用量進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖3.由圖3可知，在2×10-5mol/L亞甲基藍(lán)用量為0.80 mL時的吸收強(qiáng)度下降最大，因此亞甲基藍(lán)最佳用量可以選擇為0.80 mL.

2.5 試劑加入順序的影響

實驗過程中，考察了3 種試劑加入順序?qū)w系的影響.實驗結(jié)果表明，試劑加入順序?qū)w系沒有影響.

2.6 反應(yīng)時間的影響

在最佳實驗條件下反應(yīng)時間的影響結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，亞甲基藍(lán)與肝素鈉反應(yīng)瞬間完成，且吸收強(qiáng)度在1 h內(nèi)保持穩(wěn)定；而空白溶液吸收強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定不變，5 min以后吸收強(qiáng)度逐漸減小，但減小程度變化緩慢，對實驗產(chǎn)生的影響不大，選擇放置5 min.

2.7 干擾實驗

對多種可能共存物的干擾進(jìn)行了實驗.實驗可知，當(dāng)DNA的濃度大于11 μg/ mL時對肝素鈉的測定產(chǎn)生干擾.RNA對肝素鈉產(chǎn)生干擾的最大濃度為5 μg/ mL.

2.8 工作曲線

按照實驗步驟在最佳條件下測吸光度繪制工作曲線（見圖5），由圖5可知，0～1.6 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系.線性方程：ΔA=0.191 2c-0.002 9，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4.檢出限是 10 μg/25 mL，對于0.8 mg/L的肝素鈉5次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，說明本法準(zhǔn)確可行.盡管本法靈敏度不是太高，但有使用儀器較簡單、藥品易得且廉價，實驗方法簡便、快速、選擇性較好等優(yōu)點.

圖4 時間掃描圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9 合成樣品的分析

配制了3個合成試樣進(jìn)行測定，結(jié)果見表2.

表2 合成樣品的分析

［1］周自永.新編常用藥手冊［M］.北京：金盾出版社，1987.

［2］姬勝利，張?zhí)烀?肝素與低分子肝素的研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物雜志，1996，17（5）：216-218.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典（第二部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：307.

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［5］王云志，黃喜茹，侯海妮，等.用次甲基藍(lán)測定肝素鈉注射液的效價［J］.河北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1992，13（2）：65-67.

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