PARP1及其活性產(chǎn)物PAR在三陰性乳腺癌中的表達及意義*

李慧蘭 李 帥 翟麗麗 付 麗

·基礎研究·

PARP1及其活性產(chǎn)物PAR在三陰性乳腺癌中的表達及意義*

李慧蘭 李 帥 翟麗麗 付 麗

目的：探討聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）1及其活性產(chǎn)物聚腺苷酸二磷酸核糖（poly ADP-ribose，PAR）在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）及非TNBC中的表達及其意義。方法：應用免疫組織化學染色方法檢測PARP1及PAR在107例TNBC及116例非TNBC中表達差異，將患者分為TNBC組和非TNBC組。結果：PARP1與PAR均在細胞質或（和）細胞核呈現(xiàn)著色表達，TNBC組細胞核PARP1表達（χ2=9.258，P=0.002）及細胞質PARP1表達（χ2=3.879，P=0.049）均高于非TNBC組；TNBC組細胞核PAR表達低于非TNBC組（χ2=6.163，P=0.013），而細胞質PAR陽性表達明顯高于非TNBC組（χ2=7.454，P=0.006）。比較細胞核/細胞質PARP1及PAR表達，均未發(fā)現(xiàn)PARP1與PAR表達存在明顯的相關性。結論：在TNBC組細胞核/細胞質中PARP1均高表達，并較易表現(xiàn)為細胞質PAR陽性表達及細胞核PAR低表達，且PARP1與PAR表達無明顯相關性。

聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶1 聚腺苷酸二磷酸核糖 三陰性乳腺癌

PARP1是存在于真核細胞中催化聚ADP核糖化的細胞核酶，主要參與DNA單鏈損傷的修復過程?；罨蟮腜ARP1以ADP為底物在受體蛋白（包括自身）上合成長的、有分支的、帶負電荷的聚腺苷酸二磷酸核糖基PAR，這些PAR繼而募集到大量的DNA損傷修復蛋白，參與該處的DNA損傷修復［1］。BRCA突變相關性乳腺癌存在同源重組修復通路障礙，而PARP1參與的堿基切除修復通路是其關鍵代償途徑。PARP1抑制劑通過競爭結合PARP1的活性位點，從而抑制PARP1的活性，減少PAR的產(chǎn)生，從而起到治療BRCA突變相關性惡性腫瘤的作用［2］。

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（HER-2）均陰性的乳腺癌，其與BRCA突變相關性乳腺癌表型存在相似性［3］，但PARP1及其活性產(chǎn)物PAR在TNBC中的表達及其意義還尚未明確。本研究旨在利用免疫組織化學法檢測PARP1及其活性產(chǎn)物PAR在TNBC及非TNBC中的表達，為PARP1抑制劑可否成為治療TNBC的有效藥物提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室2010年1月至2011年12月的223例確診、且術前未接受過化療的乳腺癌患者手術切除標本，將ER、PR和HER-2均陰性歸為TNBC組，共107例；將ER、PR和HER-2中任何一項陽性歸為非TNBC組，共116例。患者均為女性，年齡為32～73歲，中位年齡53歲。本研究獲得天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會的認可。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋處理。采用非生物素超敏型PV二步法檢測乳腺癌石蠟切片中PARP1及PAR表達情況。PARP1及PAR一抗稀釋濃度均為1：200，使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。實驗步驟嚴格按照非生物素超敏型PV二步法試劑盒說明書進行。

1.2.2 結果判斷 結果判定采用雙盲法，由2位病理醫(yī)生獨立觀察。PARP1及PAR判定標準均采用QS評分方法［4］：細胞質以及細胞核內有棕色顆粒為陽性細胞，同時評價染色強度及陽性細胞百分數(shù)。染色強度分為：無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強著色為3分。陽性細胞百分比分為：1%～4%為1分，5%～19%為2分，20%～39%為3分，40%～59%為4分，60%～79%為5分，80%～100%為6分。陽性強度和陽性細胞所占比例得分相乘得到0～18分的QS得分區(qū)間，基于PARP1與PAR抗體著色特點，0～9分定為細胞核低表達，10～18分定為細胞核高表達。細胞質著色≥1%，定為細胞質著色陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。PARP1及PAR在TNBC和非TNBC組間表達差異比較采用χ2檢驗，PARP1與PAR的表達相關性比較采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

免疫組織化學法結果顯示，PARP1呈細胞質和（或）細胞核著色表達，PAR與PARP1表達相似（圖1）。

2.1 TNBC和非TNBC中細胞核/細胞質PARP1表達

TNBC組62.6%（67/107）患者表現(xiàn)為細胞核PARP1高表達，58.9%（63/107）表現(xiàn)為細胞質PARP1陽性表達，明顯高于非TNBC組（表1）。

2.2 TNBC和非TNBC中細胞核/細胞質PAR表達

TNBC組僅41.1%（44/107）患者表現(xiàn)為細胞核PAR高表達，明顯低于非TNBC組；57.9%（62/107）表現(xiàn)為細胞質PAR陽性表達，明顯高于非TNBC組（表2）。

2.3 PARP1與PAR表達相關性

通過比較PARP1與PAR細胞質及細胞核表達，均未發(fā)現(xiàn)PARP1與PAR表達存在明顯的相關性（表3）。

?A：Low expression of nuclear PARP1;B：High expression of nuclear PARP1;C：Positive expression of cytoplasmic PARP1;D：Low expression of nuclear PAR;E：High expression of nuclear PAR;F：Positive expression of cytoplasmic PAR圖1 PARP1及PAR在乳腺癌組織中的表達（PV×200）Figure 1 PARP1 and PAR expression in breast cancer（PV×200）

表1 TNBC和非TNBC中細胞核/細胞質PARP1表達Table 1 Nuclear and cytoplasmic PARP1 expression in TNBC and non-TNBC groups

表2 TNBC和非TNBC中細胞核/細胞質PAR表達Table 2 Nuclear and cytoplasmic PAR expression in TNBC and non-TNBC groups

表3 PARP1與PAR表達關系Table 3 Correlations between PARP1 and PAR expression

3 討論

PARP1抑制劑在BRCA突變相關性乳腺癌的治療方面表現(xiàn)出良好的治療效果，大多數(shù)BRCA突變的乳腺癌均呈現(xiàn)出三陰性的特征，而且發(fā)現(xiàn)TNBC中BRCA mRNA水平及BRCA表達均降低，這可能由于BRCA基因啟動子區(qū)域甲基化及BRCA負性調節(jié)因子過表達所致［5］。這些基礎研究數(shù)據(jù)使PARP1抑制劑治療散發(fā)性TNBC成為可能。另一方面，化療為TNBC的主要治療手段，雖然大多數(shù)的TNBC對化療藥物敏感，但易出現(xiàn)耐藥，體外研究表明在TNBC的治療中，化療藥物聯(lián)合PARP1抑制劑可以增強化療藥物敏感性，減少用藥量，減少副作用［6］。

O'Shaughnessy等［7］進行了一項隨機開放性Ⅱ期臨床試驗，入組的123例患者均為轉移性TNBC，試驗組接受吉西他濱、卡鉑聯(lián)合Iniparib（PARP1抑制劑）治療，對照組未聯(lián)合Iniparib。結果顯示，試驗組的受益率、有效率（ORR）、中位無病進展生存時間（PFS）以及中位總生存時間（OS）均得到顯著改善。該課題組以相同的試驗設計方法開展了Ⅲ期臨床試驗［8］，入組的519例患者均為轉移性TNBC，在同樣的入組標準和給藥方案下，試驗組雖然PFS顯著改善，但其OS未改善。雖然Ⅲ期臨床試驗未得到預期的結果，但是研究人員發(fā)現(xiàn)，一部分TNBC患者對PARP1抑制劑表現(xiàn)出較好的敏感性。早在PARP1抑制劑的Ⅰ期臨床試驗［9］，研究人員發(fā)現(xiàn)一部分BRCA突變相關性腫瘤患者對PARP1抑制劑治療不敏感。在應用PARP1抑制劑治療前，哪些患者可以真正受益于PARP1抑制劑的治療，是基礎和臨床研究亟需解決的問題。

細胞內PARP1水平引起廣大學者的關注。對PARP1基因表達的數(shù)據(jù)（n=2 485）進行Meta回顧性分析，結果顯示在三陰性乳腺癌中PARP1 mRNA水平高于其他類型的乳腺癌［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC組細胞核/細胞質PARP1表達均高于非TNBC組，進一步分析PARP1活性產(chǎn)物PAR的表達，結果發(fā)現(xiàn)在TNBC組細胞質PAR水平明顯高于非TNBC組，而在TNBC組細胞核PAR表達顯著低于非TNBC組。Zaremba等［11］選取了20種人類腫瘤細胞系，檢測其PARP1蛋白及PAR的水平，發(fā)現(xiàn)在不同的細胞系中PAR的水平差異較PARP1的表達更為明顯，但并未發(fā)現(xiàn)PARP1表達與PAR之間的相關性。本研究也未發(fā)現(xiàn)PARP1與PAR表達之間存在相關性，提示細胞內PAR水平并不依賴PARP1表達。

根據(jù)PARP1抑制劑的作用原理，抑制劑通過模擬細胞內尼克酰二核苷酸（NAD+）中煙酰胺部分結構，競爭結合PARP1的活性位點，由此可以看出PARP1抑制劑發(fā)揮作用的前提是PARP1要處于活性狀態(tài)，而PARP1活性高低直接影響PARP1抑制劑作用能否發(fā)揮。PAR作為PARP1活化后的產(chǎn)物，可直觀反映細胞內PARP1活性的高低，從而預測細胞對PARP1抑制劑的敏感性［12］。

PARP1活性而非PARP1表達水平對預測PARP1抑制劑敏感性有更為重要的指導意義。Oplustilova等［13］檢測20種細胞系對PARP1抑制劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)PAR水平高的細胞系對PARP1抑制劑更為敏感。另有研究也發(fā)現(xiàn)了細胞內的PAR水平是預測PARP1抑制劑敏感性的重要的指標［14-15］。

BRCA突變相關性乳腺癌中，由于重組修復途徑的缺陷，PARP1參與的切除修復途徑會被代償性激活，從而使PARP1活性高于BRCA正常的乳腺癌［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，TNBC組細胞質PAR而非細胞核PAR呈高表達，而且在非TNBC組也有少部分患者呈現(xiàn)細胞質PAR的表達，結果提示細胞質PAR表達可能是預測PARP1抑制劑敏感性的指標。

本研究結果提示PARP1活性產(chǎn)物PAR并不依賴于PARP1表達，僅對PARP1表達的評估并不能夠充分代表PARP1的活性狀態(tài)。PAR是否可以較好地反映PARP1活性，需要進一步的基礎與臨床研究證實，從而指導臨床PARP1抑制劑的應用。

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4 Detre S,Saclani Jotti G,Dowsett M.A"quickscore"method for immunohistochemical semiquantitation：validation for oestrogen receptor in breast carcinomas[J].J Clin Pathol,1995,48(9)：876-878.

5 Stefansson OA,Jonasson JG,Olafsdottir K,et al.CpG island hypermethylation of BRCA1 and loss of pRb as co-occurring events in basal/triple-negative breast cancer[J].Epigenetics,2011,6(5)：638-649.

6 Alli E,Sharma VB,Sunderesakumar P,et al.Defective repair of oxidative dna damage in triple-negative breast cancer confers sensitivity to inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase[J].Cancer Res, 2009,69(8)：3589-3596.

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8 O'Shaughnessy J,Schwartzberg L,Danso MA,et al.Phase III study of iniparib plus gemcitabine and carboplatin versus gemcitabine and carboplatin in patients with metastatic triple-negative breast cancer[J].J Clin Oncol,2014[Epub ahead of print].

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12 Shah GM,Kandan-Kulangara F,Montoni A,et al.Approaches to detect PARP-1 activation in vivo,in situ,and in vitro[J].Methods Mol Biol,2011,780：3-34.

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（2014-07-07收稿）

（2014-10-21修回）

（本文編輯：張亻 刡）

Expression and significance of PARP1 and PAR in triple-negative breast cancer

Huilan LI,Shuai LI,Lili ZHAI,Li FU

Research Laboratory of Breast Cancer Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institution and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,National Key Discipline of Pathology,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of Tianjin Medical University,Ministry of Education,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060, China

Li FU;E-mail:fuli@tijmu.edu.cn

Objective:To investigate the expression and significance of poly adenosine diphosphate(ADP)-ribose polymerase (PARP1)and its active product poly ADP-ribose(PAR)in triple-negative breast cancer(TNBC)and non-TNBC.Methods:Immunohistochemical staining was used to detect different expression patterns of PARP1 and PAR in 107 TNBC and 116 non-TNBC cases.Results:Immunohistochemical staining revealed different cytoplasmic and nuclear PARP1 and PAR expression patterns.Nuclear PARP1 (χ2=9.258;P=0.002)and cytoplasmic PARP1(χ2=3.879;P=0.049)expression was higher in the TNBC group than in the non-TNBC group.The nuclear PAR expression was lower in the TNBC group than in the non-TNBC group(χ2=6.163;P=0.013).By contrast,the PAR cytoplasmic expression was significantly higher in the TNBC group than in the non-TNBC group(χ2=7.454;P=0.006).No significant correlation existed between the PAR and PARP1 expression patterns either in the cytoplasm or in the nucleus.Conclusion:Nuclear or cytoplasmic PARP1 was highly expressed in TNBC.High cytoplasmic and low nuclear PAR expression patterns were commonly observed in TNBC.No significant correlation existed between PARP1 and PAR expression.

poly(ADP-ribose)polymerase-1,poly(ADP-ribose),triple-negative breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20141138

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，國家病理重點學科，天津市腫瘤防治重點實驗室，乳腺癌教育部防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：30930038）資助

付麗 fuli@tijmu.edu.cn

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

李慧蘭 專業(yè)方向為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制等。

E-mail：lihuilan1987@126.com