樹突狀細(xì)胞活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合化療治療EGFR-TKI耐藥性晚期非小細(xì)胞肺癌的療效與安全性

江冠銘袁領(lǐng)勤賈 筠林順歡蔡彥敏劉 淳吳依芬王在國(guó)黃樹林

作者單位：523018 廣東東莞1東莞市人民醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科；2乳腺科；3腫瘤外科；510006 廣州4廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)

樹突狀細(xì)胞活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合化療治療EGFR-TKI耐藥性晚期非小細(xì)胞肺癌的療效與安全性

江冠銘1袁領(lǐng)勤2賈 筠1林順歡1蔡彥敏1劉 淳1吳依芬1王在國(guó)3黃樹林4

作者單位：523018 廣東東莞1東莞市人民醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科；2乳腺科；3腫瘤外科；510006 廣州4廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院

目的 觀察負(fù)載抗原樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療表皮生長(zhǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）耐藥性晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的臨床療效及毒副反應(yīng)。方法 41例EGFR-TKI耐藥性晚期NSCLC患者分為聯(lián)合治療組和化療組。聯(lián)合治療組21例，化療前兩天抽取患者外周血液進(jìn)行DC活化T細(xì)胞增殖，化療后14 d靜脈回輸該細(xì)胞，以培美曲塞500 mg/m2靜脈滴注，d1；順鉑75 mg/m2靜脈滴注，d1。每3周重復(fù)1次?；熃M20例，以培美曲塞500 mg/m2靜脈滴注，d1；順鉑75 mg/m2，靜脈滴注，d1。每3周重復(fù)1次。觀察兩組近期療效、患者免疫功能的變化、生活質(zhì)量和毒副反應(yīng)等。結(jié)果 聯(lián)合治療組患者治療后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明顯增加，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。聯(lián)合治療組和化療組有效率分別為33.33%和30.00%（P＞0.05），疾病控制率分別為76.19%和60.00%（P＜0.05）。中位疾病無進(jìn)展時(shí)間聯(lián)合治療組為7.1個(gè)月，明顯高于化療組的3.7個(gè)月（P＜0.05）。聯(lián)合治療組患者KPS評(píng)分改善率為85.71%，高于化療組45.00%（P＜0.05）。聯(lián)合治療組患者粒細(xì)胞減少、惡心嘔吐和疲乏的發(fā)生率分別為46.6%、52.4%和23.8%，明顯低于化療組的75.0%、90.0%和65.0%（P＜0.05）。結(jié)論 負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療EGFR-TKI耐藥性晚期NSCLC的療效較好，能提高患者免疫功能和改善生活質(zhì)量，減低化療毒副反應(yīng)，安全性較好。

肺腫瘤；表皮生長(zhǎng)因子受體-絡(luò)氨酸激酶抑制劑；培美曲塞；順鉑；樹突狀細(xì)胞；TCR基因；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞

肺癌是目前全球發(fā)病位居首位的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80%，約70%的患者確診時(shí)病情已屬晚期［1］。對(duì)于表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）19/21外顯子突變的NSCLC，使用表皮生長(zhǎng)因子受體-絡(luò)氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）治療具有高效低毒的特點(diǎn)，已經(jīng)成為一線治療NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)方案，但對(duì)EGFR-TKI耐藥后的治療尚無標(biāo)準(zhǔn)，因此成為目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［2］。近年來國(guó)內(nèi)外研究表明培美曲塞聯(lián)合順鉑治療非鱗狀NSCLC的療效好，毒副反應(yīng)較低［3］。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是較為有效的專職抗原提呈細(xì)胞，可通過Ⅱ型組織相容性抗原等途徑提呈腫瘤抗原，激活受體免疫系統(tǒng)。細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)的T細(xì)胞能在體外誘導(dǎo)并大量增殖，回輸體內(nèi)后能分泌細(xì)胞因子殺滅腫瘤細(xì)胞［4］。本課題組前期進(jìn)行了腫瘤特異性TCR基因的篩選及功能的研究［5，6］。利用基因優(yōu)勢(shì)技術(shù)鑒定出兩個(gè)針對(duì)肝癌的TCRVβ基因，已成功構(gòu)建用于轉(zhuǎn)染的重組TCR雙表達(dá)質(zhì)粒脂質(zhì)體傳輸系統(tǒng)，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCR基因修飾T細(xì)胞可有效識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞，取得了較好的療效。本研究探討負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱DC活化T細(xì)胞）聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療EGFR-TKI耐藥性晚期NSCLC的近期療效和安全性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年6月至2013年5月收治經(jīng)病理學(xué)確診的Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者41例，分為聯(lián)合治療組21例和化療組20例，其中大細(xì)胞癌2例，腺癌39例，均為EGFR 19/21突變和一線使用易瑞沙或特羅凱后的耐藥者。年齡45～71歲，中位年齡62歲；41例中男性25例，女性16例；KPS評(píng)分為70～90分。全組病例均有可測(cè)量的病灶，其中合并肝轉(zhuǎn)移23例，骨轉(zhuǎn)移36例，腎上腺轉(zhuǎn)移18例，腦轉(zhuǎn)移21例。化療前心電圖、血常規(guī)及肝腎功能均正常，均無化療禁忌證。兩組患者年齡、性別、病理類型、臨床分期和KPS評(píng)分等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具可比性。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)治療 兩組患者均予培美曲塞聯(lián)合順鉑方案治療，培美曲塞500 mg/m2，靜脈滴注，d1；順鉑75 mg/m2，d1，靜脈滴注。首次使用培美曲塞前7d開始服用葉酸400 μg/d，直至治療結(jié)束，同時(shí)肌注維生素B121 000 μg，以后每3周注射1次。培美曲塞前1天、給藥當(dāng)天及給藥后1天予地塞米松4 mg口服，每天2次。順鉑給藥前后均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)水化治療。21 d為1個(gè)周期。兩組患者化療前均常規(guī)使用5-TH3受體阻滯劑預(yù)防嘔吐。治療1個(gè)周期后評(píng)價(jià)化療毒副反應(yīng)，2個(gè)周期后評(píng)價(jià)近期療效。

1.2.2 DC活化T細(xì)胞治療 聯(lián)合治療組化療前2 d抽取患者外周血液50 ml，分離外周血液T細(xì)胞并體外擴(kuò)增。以重組TCRV α12-2-Vβ7.1雙表達(dá)質(zhì)粒-脂質(zhì)體系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染T細(xì)胞。體外分離患者DC，以GMCSF及IL-4誘導(dǎo)擴(kuò)增，合成腫瘤相關(guān)抗原，DC負(fù)載腫瘤抗原。在免疫調(diào)節(jié)劑OK-432的作用下，負(fù)載腫瘤抗原的DC充分活化TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞。以CD8+、CD62L+、CD44+磁珠三步法純化中樞型記憶性CD8+T細(xì)胞?；罨U(kuò)增10～15 d取樣進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)表型測(cè)定、無菌試驗(yàn)及外源性因子的檢測(cè)。待細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)數(shù)符合要求后收獲細(xì)胞，洗滌3次，置于100 ml生理鹽水，加入IL-2 50萬U及白蛋白5 g，用輸血器進(jìn)行輸注。于化療后14 d回輸自體免疫細(xì)胞，每個(gè)療程細(xì)胞總數(shù)為（1～2）×1010個(gè)。以上治療均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者的知情同意。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照2000年《實(shí)體腫瘤客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》（RECIST 2.0），療效分為完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶和非目標(biāo)病灶均消失；部分緩解（PR）：基線病灶長(zhǎng)徑總和縮小≥30%；疾病穩(wěn)定（SD）：病灶縮小未達(dá)PR或增加未到PD，1個(gè)或多個(gè)非目標(biāo)病灶和（或）腫瘤標(biāo)志物異常；疾病進(jìn)展（PD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶，和（或）非目標(biāo)病灶進(jìn)展。以CR+PR計(jì)算有效率，以CR+PR+SD計(jì)算疾病控制率。毒副反應(yīng)評(píng)價(jià)按 NCI的 Common Toxicity Criteria（CTC）標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)［7］。生活質(zhì)量根據(jù)KPS評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，KPS提高10分以上為改善，下降10分以上為惡化，提高或下降10分及以內(nèi)者為穩(wěn)定。免疫功能評(píng)價(jià)：治療前后抽取患者外周血液，檢測(cè)患者治療前后CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+、CD95+和CD122+等免疫學(xué)指標(biāo)的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后患者外周血液免疫學(xué)指標(biāo)的變化

聯(lián)合治療組患者治療后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明顯增加，與治療前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）?；熃M治療前后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+、CD122+的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者治療前后免疫學(xué)指標(biāo)變化的比較（χ+s）

2.2 近期療效

聯(lián)合治療組和化療組的有效率分別為33.33%和30.00%（P＞0.05）。兩組疾病控制率分別為76.19%和60.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中位疾病無進(jìn)展時(shí)間聯(lián)合治療組為7.1個(gè)月，明顯高于化療組的3.7個(gè)月（P＜0.05）。

2.3 生活質(zhì)量改善

聯(lián)合治療組18例患者KPS評(píng)分提高，平均提高10～20分，生活改善率為85.71%，明顯優(yōu)于化療組患者KPS提高的9例和生活改善率的45%（P＜0.05）。

2.4 毒副反應(yīng)

聯(lián)合治療組患者粒細(xì)胞減少、惡心嘔吐和疲乏無力的發(fā)生率分別為47.62%、52.38%、23.81%，明顯低于化療組的75.00%、90.00%、65.00%（P均＜0.05），兩組患者貧血、血小板下降、脫發(fā)、變態(tài)反應(yīng)、外周神經(jīng)毒性、肝功能和腎功能損害等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 兩組患者毒副反應(yīng)的比較（n）

3 討論

臨床上使用EGFR-TKI治療EGFR突變的NSCLC，其療效較好且毒副反應(yīng)少，明顯改善患者生活質(zhì)量。對(duì)EGFR-TKI的耐藥性研究，是目前學(xué)者們研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究顯示引起腫瘤原發(fā)性耐藥的有K-ras和BRAF基因突變以及PTEN的失活等；繼發(fā)性耐藥有EGFR二次突變、MET基因擴(kuò)增、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子過表達(dá)、HER-2和IGF1-R過表達(dá)等［8］。Yang等［9］報(bào)道治療NSCLC EGFR-TKI耐藥的3種模式，但臨床上難以推廣，因此目前尚無治療EGFR-TKI耐藥的NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)方法。化療是EGFR-TKI耐藥后常用的治療手段，Scagliotti等［10］進(jìn)行一項(xiàng)前瞻性、多中心、隨機(jī)對(duì)照的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，即JMDB研究。結(jié)果肺腺癌和大細(xì)胞癌患者使用培美曲塞聯(lián)合順鉑方案的總生存期為12.6個(gè)月，明顯優(yōu)于吉西他濱聯(lián)合順鉑組的10.9個(gè)月。2008年培美曲塞被FDA批準(zhǔn)為NSCLC的一線治療藥物。

腫瘤免疫耐受是腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫監(jiān)視的重要機(jī)制之一。細(xì)胞免疫治療是解決免疫耐受的重要途徑，目前臨床上已用淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocyte，TIL）、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）、DC和DC-CIK等治療各種腫瘤，其抗腫瘤效果較好且得到不斷提高，但目前將過繼性細(xì)胞應(yīng)用于非病毒類實(shí)體瘤的治療還存在不少問題亟待解決，如缺乏識(shí)別腫瘤抗原的特異性，回輸?shù)拿庖呒?xì)胞尤其是克隆化CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)難以持久地存活，腫瘤患者體內(nèi)存在的腫瘤免疫耐受與免疫抑制將同時(shí)影響效應(yīng)細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的功能，使其處于無能狀態(tài)。我們?cè)谇捌谘芯恐欣没蚣夹g(shù)篩選獲得可特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞的TCRVβ7.1基因，構(gòu)建了重組TCRVα12-2-Vβ7.1雙表達(dá)的質(zhì)粒載體，在DC充分活化TCR基因修飾T細(xì)胞后，通過記憶性T細(xì)胞的表面標(biāo)記篩選純化記憶性T細(xì)胞，回輸患者體內(nèi)治療肝癌和肺癌，其效果較佳［6，11］。

本研究我們嘗試用負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療EGFRTKI耐藥性晚期NSCLC，以探討新的治療模式。結(jié)果聯(lián)合治療組患者治療后外周血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD95+和CD122+明顯增加，與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），聯(lián)合治療組比化療組明顯改善患者的免疫狀態(tài)。聯(lián)合治療組疾病控制率和中位疾病無進(jìn)展時(shí)間均明顯優(yōu)于化療組（P均＜0.05）。聯(lián)合治療組患者KPS評(píng)分明顯提高，改善了患者生活質(zhì)量。毒副反應(yīng)方面聯(lián)合治療組患者粒細(xì)胞減少、惡心嘔吐和疲乏無力的發(fā)生率均明顯低于化療組（P均＜0.05）。負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療EGFRTKI耐藥性的NSCLC沒有發(fā)生新的毒性反應(yīng)，治療較安全、有效。

綜上所述，負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞聯(lián)合培美曲塞、順鉑治療EGFR-TKI耐藥性晚期NSCLC的療效較好，能提高患者免疫功能及改善生活質(zhì)量，減低化療毒副反應(yīng)，安全性較好，可作為一種新的治療模式進(jìn)一步探討，尤其是負(fù)載抗原DC活化TCR基因轉(zhuǎn)染記憶性T細(xì)胞治療腫瘤的毒副反應(yīng)、應(yīng)用方案和化療聯(lián)合應(yīng)用的時(shí)機(jī)等值得深入研究。

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［2013-11-08收稿］［2013-12-13修回］［編輯 阮萃才］

Efficacy and safety of combining infusion of antigen-activated，TCR gene-transfected memory T cells combined with chemotherapy for treating advanced non-small cell lung cancer resistant to EGFR-TKIs

JIANG Guan-ming1，YUAN Ling-qin2，JIA Yun1，LIN Shun-huan1，CAI Yan-min1，LIU Chun1，WU Yi-fen1，WANG Zai-guo3，HUANG Shu-lin4（1Department of Medical Oncology，Dongguan People′s Hospital；2Department of Breast Surgery，3Department of Tumor Surgery，Dongguan People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，523018，P.R.China；4College of Life Science and Biotechnology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，P.R.China）

JIA Yun.E-mail：dgryjy@sina.com

Lung neoplasm；EGFR-TKI；Pemetrexed；Cisplatin；Dendritic cell；TCR gene；Cytokine-induced killer cell

standard chemotherapy involving a 3-week regime of pemetrexed（500 mg/m2）and cisplatin（75 mg/m2），or into a group（n=21）that received the same chemotherapy after harvesting，culturing and intravenously infusing DC-activated T cells.Curative effects，immune function，quality of life and adverse reactions were compared between the two treatments.Results Combining infusion of DC-activated T cells with chemotherapy significantly increased serum populations of CD3+，CD4+，CD8+，CD95+，and CD122+cells，as well as the CD4+/CD8+ratio.Combination therapy and standard chemotherapy alone gave similar overall response rates of 33.33%and 30.00%（P＞0.05），respectively，but combination therapy led to a significantly higher disease control rate（76.19%vs 60.00%，P＜0.05），longer median progression-free survival（7.1 vs 3.7 months，P＜0.05），and a higher rate of improvement in KPS（karnofsky performance status）improvement rate（85.71%vs 45.00%，P＜0.05）.At the same time，combination therapy was associated with much lower rates of neutropenia（46.6%vs 75.0%），nausea（52.4%vs 90.0%）and fatigue（23.8%vs 65.0%，P＜0.05）.Conclusion Combining infusion of antigen-activated memory T cells with pemetrexed and cisplatin chemotherapy improves therapeutic response and immune function while also reducing side effects when treating patients with advanced non-small cell lung carcinoma resistant to EGFR-TKIs.This promising therapeutic approach should be explored further.

東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（201110515000370）【通信作者】賈 筠。E-mail：dgryjy@sina.com

R734.2

A

1674-5671（2014）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.14

【Abstract】Objective To examine whether infusion of antigen-activated memory T cells transfected with TCR genes alters the clinical efficacy and toxicity of pemetrexed-cisplatin combination chemotherapy to treatin the treatment of advanced non-small cell lung cancer resistant to EGFR-TKIs.Methods A total of 41 patients with non-small cell lung cancer were randomized into a group（n=20）that