高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及肥胖抵抗小鼠腸道菌群元基因組的比較研究

王 歡，李宛真，汪弋力，胡玲香，丁維俊

(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都 611137)

肥胖病是由于體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常，造成體重增加的一種慢性代謝紊亂性疾病[1]，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)患病排名的第6位，是世界關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題[2]。在集中研究已肥胖個(gè)體之外，近年來(lái)研究者也開始關(guān)注食用高脂肪食物卻不肥胖的人群。LEVIN等[3-4]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可誘導(dǎo)肥胖發(fā)生，但不同個(gè)體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖的易感性卻存在差異，發(fā)生肥胖者稱為飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced-obesity, DIO)，不發(fā)生肥胖者稱為飲食誘導(dǎo)肥胖抵抗(diet-induced-obesity-resistant, DIO-R)。雖然肥胖的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但近年來(lái)國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)被視為人類“第二基因組”的腸道菌群與肥胖的發(fā)生有著密切關(guān)系[5-7]，并被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)[8-10]。為了探究DIO與DIO-R中腸道菌群的差異，深入認(rèn)識(shí)兩者的發(fā)生與人體內(nèi)微生物群落之間的關(guān)系，為尋找有效的防治肥胖措施提供依據(jù)，本研究通過給予小鼠高脂飲食建立肥胖及肥胖抵抗模型，比較DIO、DIO-R和普通小鼠腸道菌群元基因組水平，并間接了解肥胖的發(fā)生與腸道菌群變化的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠40只，鼠齡8周，體質(zhì)量(20±3.5)g，購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2模型建立高脂飼料參照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的肥胖造模方法，并稍加改進(jìn)為：普通飼料60%、豬油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、雞蛋10%、麻油2%、食鹽1%。委托北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

將所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料(SFP級(jí)鼠飼料)2周后，隨機(jī)分為2組：模型組30只，喂食高脂飼料；正常組10只，繼續(xù)喂食普通飼料。造模期間所有小鼠均自由攝食、飲水，飼料和水每日更換1次，每周稱量小鼠體重1次。造模8周后，按體重增長(zhǎng)率超過正常組平均體重增長(zhǎng)率的1.96個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為肥胖小鼠的判定標(biāo)準(zhǔn)[3]，從模型組中篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的DIO小鼠21只，其余作為DIO-R小鼠組，共8只。

1.3樣品采集與處理采用腹部按摩法收集小鼠0.1～0.3 g糞便，按照柱式糞便DNA out試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)說明書操作，立即提取糞便菌群基因組DNA。提取后的DNA均保存于-20 ℃。所檢測(cè)標(biāo)本包括3個(gè)：正常組(N組)：健康對(duì)照鼠實(shí)驗(yàn)過程中3次取大便，立即提取DNA，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，每個(gè)DNA樣本各取15 μL，混合而成。DIO組(M組)：造模成功小鼠，取樣4次，立即提取DNA，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，每個(gè)DNA樣本各取10 μL，混合而成。DIO-R組(C)：肥胖造模不成功小鼠，即DIO-R組小鼠，取樣3批次，立即提取DNA，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，每個(gè)DNA樣本各取15 μL，混合而成。

1.4腸道菌群元基因組的測(cè)定將提取基因組DNA送深圳華大基因研究院，經(jīng)檢測(cè)合格后，采用Illumina公司的Hiseq2000分析3個(gè)樣本的腸道元基因組物種組成，此步驟委托深圳華大基因研究院完成。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，對(duì)小鼠體質(zhì)量比較差異的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1造模開始前及成功后3組小鼠體質(zhì)量的變化造模開始前，3組小鼠體質(zhì)量無(wú)差異(P>0.05)；造模開始8周后，DIO組體質(zhì)量與正常組體質(zhì)量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，其體質(zhì)量增長(zhǎng)率超過正常組平均體質(zhì)量增長(zhǎng)率的1.96個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，造模成功；DIO-R組小鼠與正常組體質(zhì)量比較無(wú)差異；DIO組體質(zhì)量與DIO-R組體質(zhì)量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，表1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化

與正常組比較*P<0.01； 與DIO組體質(zhì)量差比較，#P<0.01。

2.2基因注釋結(jié)果ORFs與NR、eggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。每個(gè)樣品的物種注釋中約72%以上的ORF注釋到門及以下級(jí)別，但仍有20%以上的ORF未注釋到物種庫(kù)，以DIO組最高(23.25%)，說明其中有很多物種仍待發(fā)掘。且在eggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋中，很大一部分基因未完善功能定義，以DIO組的未知功能為最多。

表2 物種注釋及功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

注：ORF物種注釋統(tǒng)計(jì)的是在門級(jí)別信息，Unknown 為未比對(duì)上物種庫(kù)的ORF；Unclassified 為比對(duì)上物種庫(kù)，但未注釋到門及以下級(jí)別的ORF； Classified 為能注釋到門及以下級(jí)別 ORF；功能注釋包括eggNOG 注釋信息、KEGG Orthology 注釋信息和 Pathway注釋信息，Annotated為注釋到該功能ORF，Unannotated為未注釋到該功能的ORF。

2.3ORFs與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因功能注釋結(jié)果KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的主要功能之一是提供分子相互作用和代謝通路圖，每張通路圖可由4個(gè)層次的分類組成。先通過KEGG Orthology數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋得到第1層功能分類，針對(duì)第1層每個(gè)功能分類進(jìn)行系統(tǒng)分類為2、3、4層。其中第2層目前包括有39種子功能；第3層即為其代謝通路圖；第4層為每個(gè)代謝通路圖的具體注釋信息。將其在前兩個(gè)層次的功能分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制柱狀圖(圖1)，可直觀顯示代謝功能分布情況。從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因功能注釋結(jié)果所注釋到的基因功能主要分布于代謝(metabolism)、基因信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息的處理(environmental information processing)和細(xì)胞的加工處理(cellular processes)4個(gè)區(qū)域。在代謝途徑的12個(gè)子功能中，DIO組執(zhí)行多糖代謝、氨基酸代謝的基因數(shù)均較低于DIO-R組；在基因信息處理的子功能中，DIO組執(zhí)行基因信息翻譯的基因數(shù)低于DIO-R組；在環(huán)境信息處理的子功能中，DIO組執(zhí)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因數(shù)顯著高于DIO-R組；在細(xì)胞能動(dòng)性上，DIO組基因數(shù)亦明顯高于DIO-R組。其余代謝功能無(wú)明顯差異。正常組小鼠腸道菌群中執(zhí)行代謝功能的基因數(shù)均明顯多于DIO組和DIO-R組，尤其是調(diào)控核苷酸代謝、脂肪代謝、多糖代謝、能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸及相應(yīng)酶的代謝的基因；基因信息處理的子功能中，正常鼠中執(zhí)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制與修復(fù)、折疊、排序和降解基因數(shù)亦明顯高于DIO組和DIO-R組；而在執(zhí)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞能動(dòng)性基因數(shù)上，正常組處于DIO組與DIO-R組之間。

圖1 各組的KEGG二級(jí)代謝的注釋結(jié)果

2.4ORFs與eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因功能注釋結(jié)果將ORFs與eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因功能注釋結(jié)果繪制成柱狀圖(圖2)，可直觀地看出代謝功能分布的情況：雖然注釋到每個(gè)功能的基因數(shù)與KEGG注釋的結(jié)果略有差異，但執(zhí)行每個(gè)功能的基因數(shù)在3組中的變化情況與KEGG注釋中的變化情況一致，即DIO組中執(zhí)行E(氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝)、J(翻譯)功能的基因數(shù)較低于DIO-R組；而執(zhí)行N(細(xì)胞能動(dòng)性)、T(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))功能的基因數(shù)顯著高于DIO-R組。正常組與兩組各功能基因數(shù)差異的變化趨勢(shì)同KEGG注釋中的情況一致。

2.5ORFs的物種注釋結(jié)果根據(jù)物種注釋結(jié)果對(duì)所有基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算腸道菌的門級(jí)別水平的基因在該樣品中的比例。DIO組變形桿菌門較DIO-R組高近16%,類桿菌門較DIO-R組與正常組明顯下降，降低將近20%；厚壁菌門較DIO-R組升高8%，類桿菌/厚壁菌的比值較DIO-R組與正常組明顯下降。DIO-R組變形桿菌門約為正常組的1/2；其余無(wú)明顯差異。DIO組放線菌門也稍有增高(表3)。

圖2 各組的eggNOG注釋結(jié)果的功能大類

表3 腸道菌群門級(jí)水平相對(duì)百分比含量

注：其他為含有基因個(gè)數(shù)較少的門的集合；NA為未注釋上門級(jí)別的基因。

3討論

LEVIN等[3-4]在實(shí)驗(yàn)中觀察到，同一品系、同一批大鼠食用相同的高脂飼料，其中部分大鼠發(fā)生肥胖，部分大鼠不發(fā)生肥胖，由此開啟了DIO與DIO-R的對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)在高脂飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周末，已有大部分小鼠表現(xiàn)出明顯肥胖，而DIO-R小鼠體重與正常組沒有差別，這與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的一致。

越來(lái)越多的研究證實(shí)了腸道菌群與肥胖的相關(guān)性[13]。有研究證實(shí)，不同飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物，其腸道菌群組成有所差異[14-15]。由于大多數(shù)微生物目前還難以在實(shí)驗(yàn)室分離和培養(yǎng)[16]，故本實(shí)驗(yàn)采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3組小鼠腸道菌群進(jìn)行了元基因組的檢測(cè)，通過與3類蛋白庫(kù)的對(duì)比，基因注釋結(jié)果顯示：DIO小鼠與DIO-R小鼠腸道菌群在執(zhí)行多糖代謝、氨基酸代謝、基因信息翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞能動(dòng)性多種功能基因數(shù)上有差異，且兩者較正常組相對(duì)應(yīng)功能的基因數(shù)顯著降低。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的肥胖患者腸道菌群有很高的物質(zhì)代謝能力，提高了機(jī)體對(duì)食物的能量收獲率相矛盾[17-18]。這可能是本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠數(shù)量較少且動(dòng)物間有種屬差異以及3個(gè)樣品的功能注釋中的未知部分，可能對(duì)腸道細(xì)菌基因功能認(rèn)識(shí)有嚴(yán)重缺陷[19]。另外，機(jī)體腸道微生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)主要代謝功能為對(duì)膳食中難消化物質(zhì)的發(fā)酵，其產(chǎn)生的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)除了可供宿主吸收利用外，也供給菌體自身的生長(zhǎng)繁殖、代謝。因此，可能其代謝能力增強(qiáng)并不一定意味著宿主可以吸收更多能量而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中正常組小鼠代謝能力明顯高于肥胖組的結(jié)果也可說明，同時(shí)提示DIO及DIO-R都處于不健康的代謝紊亂狀態(tài)，但尚需實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

研究表明，高脂飲食會(huì)使腸道菌群養(yǎng)料來(lái)源(主要是未被小腸消化吸收的碳水化合物)的生成減少，導(dǎo)致短鏈脂肪酸的生成減少，從而使血脂的調(diào)節(jié)功能受到抑制[20]，而且高脂飲食代謝的副產(chǎn)物也會(huì)破壞菌群賴以生存的微環(huán)境[21]，影響腸道菌群的生態(tài)平衡，導(dǎo)致正常的腸道菌群紊亂。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)樣品代謝核心菌群分析的結(jié)果顯示，DIO組類桿菌/厚壁菌的比值較DIO-R組和正常組明顯下降，變形桿菌門較DIO-R組高近16%，DIO-R組變形桿菌門約為正常組的1/2。變形桿菌門屬革蘭氏陰性桿菌，通過產(chǎn)生內(nèi)毒素，參與肥胖的發(fā)生[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DIO小鼠腸道菌群中變形桿菌門升高及DIO-R變形桿菌門下降。將物種注釋結(jié)果與功能注釋結(jié)果比對(duì)后可知，DIO小鼠腸道菌群厚壁菌升高，類桿菌降低后，反而代謝能力隨之降低，這與KALLUS等[24]報(bào)道的厚壁菌門相對(duì)于類桿菌門能產(chǎn)生相對(duì)完全的能量代謝，促進(jìn)吸收更多的熱量，維持肥胖的進(jìn)程的結(jié)果似乎相矛盾。故本實(shí)驗(yàn)尚需改善實(shí)驗(yàn)方案，并重復(fù)驗(yàn)證。另外，對(duì)在物種注釋結(jié)果中25%～28%的未知微生物基因也有待進(jìn)一步研究。

隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高和膳食模式的改變、運(yùn)動(dòng)量的日益減少，超重、肥胖的患病率越來(lái)越高；而與肥胖相對(duì)立的肥胖抵抗?fàn)顩r的存在，從對(duì)立面為解決肥胖問題提供了新途徑，也應(yīng)獲得足夠重視。深入探討飲食誘導(dǎo)肥胖與肥胖抵抗時(shí)腸道菌群差異的分子水平作用機(jī)制以及對(duì)腸道菌群種類的研究及調(diào)整，將有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 謝長(zhǎng)才，孫健，于濤，等. 針刺對(duì)單純性肥胖臨床治療探析[J]. 新中醫(yī)，2012, 44(1):97-99.

[2] LOW S, CHIN MC, DEURENBERG YM. Review on epidemic of obesity[J]. Ann Acad Med Singapore, 2009, 38(1):57-59.

[3] LEVIN BE, TRISCARI J, SULLIVAN AC. Metabolic features of diet-induced obesity without hyperphagia in young rats[J]. Am J Physiol, 1986, 251(3 Pt 2):433-440.

[4] LEVIN BE, TRISCARI J, HOGAN S, et al. Resistance to diet-induced obesity: food intake, pancreatic sympathetic tone, and insulin[J]. Am J Physiol, 1987, 252(3 Pt 2):471-478.

[5] LEY RE, BCKHED F, TURNBAUGH P, et al. Obesity alters gut microbial ecology[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(31):11070-11075.

[6] LEY RE, TURNBAUGH PJ, KLEIN S, et al. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity[J]. Nature, 2006, 444(7122):1022-1023.

[7] TILG H, KASER A. Gut microbiome, obesity, and metabolic dysfunction[J]. J Clin Invest, 2011, 121(6):2126-2132.

[8] CANI PD, DELZENNE NM. The role of the gut microbiota in energy metabolism and metabolic disease[J]. Curr Pharm Des, 2009, 15(13):1546-1558.

[9] TURNBAUGH PJ, HAMADY M, YATSUNENKO T, et al. A core gut microbiome in obese and lean twins[J]. Nature, 2009, 457(7228):480-484.

[10] LEY RE. Obesity and the human microbiome[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2010, 26(1):5-11.

[11] 孫志，張中成，劉志誠(chéng)．營(yíng)養(yǎng)性肥胖動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(4)：466-467.

[12] 王舒然，麻微微，趙丹，等. 高脂飲食誘導(dǎo)肥胖與肥胖抵抗動(dòng)物模型建立[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2007，23(7)：774-775.

[13] 劉偉偉，嚴(yán)敏，周麗萍，等. 肥胖與腸道菌群的相關(guān)性[J]. 生命的化學(xué)，2009，29(6)：928-932.

[14] 張翼，張晨虹，申劍，等. 膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型的腸道菌群結(jié)構(gòu)及其特異分子標(biāo)識(shí)物[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(4):318-322,326.

[15] 李后開. 肥胖易感與肥胖抵抗大鼠的代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2008：1-112.

[16] 周丹燕，戴世鯤，王廣華，等. 宏基因組學(xué)技術(shù)的研究與挑戰(zhàn)[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2011, 38(4):591-600.

[17] TURNBAUGH PJ, LEY RE, MAHOWALD MA, et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J]. Nature, 2006, 444(7122):1027-1031.

[18] PANG X, HUA X, YANG Q, et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs[J]. ISME J, 2007, 1(2):156-162.

[19] QIN J, LI R, RAES J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature, 2010, 464(7285):59-65.

[20] 任婷婷，盧放根，張尤歷，等. 高脂飲食對(duì)SD大鼠腸道菌群的影響[J]. 世界華人消化雜志，2010, 18(25):2694-2697.

[21] 肖俊松，單靜敏，曹雁平，等. 多酚通過腸道菌群調(diào)節(jié)能量代謝研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué)，2012，33(3):300-303.

[22] RESTA SC. Effects of probiotics and commensals on intestinal epithelial physiology: implications for nutrient handling[J].J Physiol, 2009, 587(Pt 17):4169-4174.

[23] ATTENE RM, NAVA GM, MUELLNER MG, et al. DNA damage and toxicogenomic analyses of hydrogen sulfide in human intestinal epithelial FHs 74 Int cells[J]. Environ Mol Mutagen, 2010, 51(4):304-314.

[24] KALLUS SJ, BRANDT LJ. The intestinal microbiota and obesity[J]. J Clin Gastroenterol, 2012, 46(1):16-24.