人不同孕期胎盤組織中實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇

趙 晶，趙俊杰，康麗麗，李亞清，王 斌，雷艷霞

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 第一附屬醫(yī)院血液科；2. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，陜西西安 710061；3. 長安區(qū)醫(yī)院，陜西西安 710100)

實時熒光定量PCR(QPCR)是近年來最常用的快速、準(zhǔn)確定量檢測低豐度mRNA的敏感方法。使用內(nèi)源性管家基因(housekeeping gene)作為內(nèi)參照物進行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以去除不同標(biāo)本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達的真正差異，是QPCR中常采用的相對定量方法。3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和β肌動蛋白(β-actin)是最常用的管家基因。但是，近年來我們在研究中發(fā)現(xiàn),在不同類型的細胞和組織、細胞增殖和器官發(fā)育的不同階段、體外培養(yǎng)等各種實驗條件情況下，它們的表達量通常變異較大。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)；另一方面可能導(dǎo)致錯誤甚至相反的結(jié)論。因此，選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測標(biāo)本間的差異是QPCR實驗成功的關(guān)鍵。本文采用實時熒光定量PCR方法，分析了妊娠早、中、晚孕期及妊高征、子癇胎盤組織中GAPDH、β-actin、RNA聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、β2微球蛋白、18S核糖體RNA(18SrRNA)管家基因的表達，了解胎盤組織在發(fā)育的不同階段及病理條件下上述管家基因的表達變異情況，選擇出該研究的最適管家基因，為正確應(yīng)用、PCR技術(shù)準(zhǔn)確、真實的反映基因特異性表達提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1研究對象選取2009年1月至2010年1月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診非醫(yī)學(xué)原因自愿要求人工流產(chǎn)的健康婦女絨毛組織(妊娠6～10周)20例；同期在該院婦產(chǎn)科住院自愿引產(chǎn)中期妊娠(妊娠16～28周)孕婦,采用剖宮取胎術(shù)或水囊引產(chǎn)術(shù)終止妊娠之胎盤組織15例；同期住院之正常晚期妊娠胎盤組織20例。研究對象均已簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本處理經(jīng)無菌負壓吸宮術(shù)獲得絨毛組織,胎盤娩出后立即剪取胎盤中央、臍帶附著部周圍胎盤組織母體面(避開鈣化灶及機化灶)約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm。立即放入1.5 mL Eppendorf管中(已預(yù)先經(jīng)DEPC水處理)，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑和儀器RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，熒光熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa Biotechnology公司。儀器為美國PE公司ABI Prisnxr7000熒光定量PCR儀。引物設(shè)計與合成由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司提供(表1)。

表1 內(nèi)參基因引物序列

1.4方法

1.4.1RNA的提取 應(yīng)用Trizol試劑盒，按說明書要求提取RNA，并用Nano Drop ND-1000分光光度計測定含量和純度。A280/A260≥1.8為合格。所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28S、18S兩條區(qū)帶，證明其完整性。-70 ℃保存待用。

1.4.2cDNA的合成 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Fermentas 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒[RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(K1621)]，按說明書操作。用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer測定cDNA含量與純度，所合成的cDNA可直接用于PCR或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3熒光定量PCR 采用TaKaRa Biotechnology公司的 SYBY Premix ExTaqTMⅡ試劑盒，按說明書進行操作。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 Cycles。同時，用經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)系列稀釋后(101～105)，與被檢樣本同時擴增，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被檢樣品的mRNA表達。

1.4.4內(nèi)參基因RNA轉(zhuǎn)錄水平變化的比較及穩(wěn)定性分析 內(nèi)參基因RNA轉(zhuǎn)錄水平差異的比較直接用各樣本的CT值比較。內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析應(yīng)用GeNorm程序分析軟件，在Excel中設(shè)定不同樣本中某一看家基因值最小者的表達量為1，其他樣本此看家基因的相對表達量則為2-△CT(△CT=各樣本CT值-最小CT值)。將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Genom程序，計算各基因表達穩(wěn)定度的平均值M，對管家基因表達穩(wěn)定度進行排序，M值越小，表達越穩(wěn)定。

2結(jié)果

2.1不同孕期組織內(nèi)參基因mRNA的變化在早、中、晚不同孕期的絨毛或胎盤組織中內(nèi)參基因GAPDH mRNA表達水平變化最大，其中在早孕絨毛組織中表達水平最高，隨著孕期的延長其表達水平逐漸降低，標(biāo)本間CT值變化范圍17.11～30.12。內(nèi)參基因β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平則呈相反的趨勢變化，標(biāo)本間CT值范圍變化亦較大(18.21～29.55)。內(nèi)參基因β2-M、18S和UBC mRNA表達水平在不同孕期標(biāo)本間變化相對較小，其中內(nèi)參基因RPⅡmRNA表達水平在不同孕期標(biāo)本間變化最小(CT值范圍25.46～31.23，圖1)。

圖1 內(nèi)參基因CT絕對值的變化

2.2內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析應(yīng)用GeNorm程序分析軟件對所選的內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性分析及排序，內(nèi)參基因GAPDH、β-actin、β2-M、18S rRNA、UBC、RPⅡ的M值分別為0.22、0.18、0.16、0.14、0.12、0.08(圖2)。M值越小，基因表達穩(wěn)定度就越高；反之，M值越大,基因表達穩(wěn)定度就越低。因此，所選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度由高到低依次為RPⅡ>UBC>18S rRNA>β2-M>β-actin>GAPDH。

圖2 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的比較

3討論

實時熒光定量PCR是基因表達分析研究中應(yīng)用十分廣泛的方法之一，選擇表達穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因的重要性已為大家所共識。近年來，研究人員對于多種組織中內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行了廣泛研究[1-6]。結(jié)果提示，迄今為止適用于所有類型的細胞/組織所通用的內(nèi)參基因可能不存在。研究者應(yīng)根據(jù)所研究的細胞或組織尋找適合各自實驗系統(tǒng)的特異性穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，以保證實驗結(jié)果的可靠性。

目前，對某種基因表達的研究不再基于一個時間點和或一種組織[7]，基因表達譜和表達特性的相關(guān)研究已經(jīng)成為熱點。實時熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于妊娠期胎盤發(fā)育進展及疾病的基因表達發(fā)育性變化研究[8-10]，但在此類基因表達研究中，研究者多采用傳統(tǒng)的管家基因(GAPDH、β-actin)作為內(nèi)參，對目的基因進行標(biāo)準(zhǔn)化，但如果選擇的內(nèi)參基因在該組織中并不是穩(wěn)定表達，可能對實驗結(jié)果造成影響，導(dǎo)致基因表達檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差或相悖。目前，尚未見妊娠期胎盤發(fā)育性變化過程中基因表達研究的有關(guān)內(nèi)參基因選擇的報道。在本研究中，作者采用實時熒光定量PCR方法檢測了早、中、晚不同孕期絨毛或胎盤組織中6種內(nèi)參基因(GAPDH、β-actin、RPⅡ、β2-MG、18S rRNA、UBC)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達情況。結(jié)果表明，常用的內(nèi)參基因GAPDH、β-actin RNA在不同孕期標(biāo)本間表達差異明顯，且表達變化趨勢相反；GAPDH在早孕絨毛中mRNA表達水平最高，隨著孕期的延長其表達水平逐漸降低，β-actin RNA轉(zhuǎn)錄水平則呈相反的趨勢變化。如果分別采用GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M行標(biāo)準(zhǔn)化，可能對實驗結(jié)果造成影響，導(dǎo)致基因表達檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差或相悖。應(yīng)用GeNorm程序分析軟件對所選的內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性分析及排序，在6種內(nèi)參基因中，RPⅡ基因表達較為穩(wěn)定，不同標(biāo)本間變化較小，所選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度由高到低依次為RPⅡ>UBC>18S rRNA>β2-M>β-actin>GAPDH。結(jié)果提示，在對不同孕期及異常妊娠胎盤組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平基因表達研究時，不但生長調(diào)控相關(guān)基因呈現(xiàn)出顯著的發(fā)育性變化，而且多種常作為內(nèi)參基因的管家基因亦呈現(xiàn)出顯著的發(fā)育性變化或差異表達特性。故在相關(guān)研究中，內(nèi)參基因的選擇就成為實驗的關(guān)鍵和難點，如果不符合條件的看家基因被選擇作為內(nèi)參基因，將會直接影響目的基因表達的結(jié)果評估。在本研究中，傳統(tǒng)的內(nèi)參基因GAPDH和β-actin并不適合，RPⅡ是最有用的候選內(nèi)參基因。

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